微型生态系统共培养技术从海洋微生物中发现新颖抗生素活性天然产物的研究

Premised on the concept of community-mediated activities of microorganism, the technique of artificial microbial communities will be developed using polycarbonate membrane to separate the synthetic marine microbial communities. The polycarbonate membrane allows small molecules to act as cross-talking messengers between the synthetic marine microbial communities. The advances of synthetic micro-scale ecosystems technique are as follows: 1) Since the mechanism of reciprocal syntrophy and competition co-exist in the artificial microbial communities, the chemical diversity and antibiotic activities of the secondary metabolites will be enhanced. 2) The culturability will be improved. 3) The synthetic micro-scale ecosystems will boost up the ability to combat the environmental stress, increasing the chemical diversity and antibiotic activities of the compounds produced. This technique is specifically designed for the microorganisms from harsh environment such as the ocean. Moreover, it is applicable to discover novel antibiotics from known microorganisms whose secondary metabolites have already been unveiled.

基于对微型生态网络群落调解活动的认识，我们提出崭新的人工界面引入的微型生态系统培养(synthetic community)，是以海洋微生物菌团之间独立生长，一定密度和组织结构的微生物群体系统相互独立，在此基础上通过微孔膜进行小分子物质交换。该方法的优势在于1）菌群之间互惠互养和生存竞争同时存在，开启沉默基因的表达和增加酶活性，大大增加的二次代谢产物的化学多样性和抗生素活性；2）增加微生物的可培养性；3）新型培养体系增加微生物抗环境压力的能力，进而增加新颖化合物发现的几率。该方法特别适用于从海洋极端环境中发现具有抗病原微生物活性的天然产物，也可以对大量二次代谢产物谱清晰的菌种进行二次研究和开发，增加从已知种属中发现新颖抗生素的可能性。

微生物次级代谢产物一直都是新型药物先导化合物的宝贵资源库。然而，常规的天然产物分离研究目前已面临两个日益严峻的难题：第一个问题是常规培养条件下次级代谢生物合成基因簇的沉默现象阻碍了对这一资源库的高效挖掘，第二个问题是已知化合物的重复分离现象在微生物次级代谢产物分离过程中日益普遍，已造成了大量实验精力与资源的双重浪费。本文采用重金属胁迫与微生物共培养两条技术路线来诱导海底热液口微生物次级代谢沉默基因簇的表达，并结合代谢组学策略快速定位及分析激活沉默基因簇后新产生的次级代谢产物，实现了微生物常规培养条件下隐蔽的活性天然产物的高效筛选与对这些隐蔽天然产物化学生态学功能的初步探讨。主要研究内容及结果如下:.1）综合重金属胁迫培养体系和代谢组学分析方法设计了一个海底热液口放线菌隐蔽抗生素发现策略，通过应用这一抗生素发现策略，我们快速海洋微生物中发现新颖的高活性化合物。.2）新设计了一个菌种间物理分隔但是互相可以进行化学物质交换的多菌种跨膜共培养装置，并且通过综合质谱分析，多变量数据分析及质谱分子网络化等多种技术建立了菌种间化学交流下微生物隐蔽天然产物的发现策略。结合这一新装置和代谢组学策略，我们研究了菌种间化学接触对一个真菌-细菌人工群落及一个放线菌-放线菌人工群落的次级代谢组的影响作用。结果显示菌种间化学交流能对人工共培养群落的次级代谢产生显著影响，可以诱导共培微生物新合成或增加分泌一系列分子。.3）构建了一个由热液口橘青霉Penicillium citrinum Y34与模式细菌绿脓杆菌Pseudomonas aeruginosa CMCC(B)10104组成的跨膜共培养体系，通过质谱分子网络化的方法揭示了共培养体系中丰度较低的新橘霉素类分子。为了增加这些新代谢产物在共培养体系中的产量，我们新设计了一个加速菌种间化学交换的机械循环式共培养装置。结合多变量数据分析与质谱分子网络化技术筛选得到机械循环式共培体系中与化学交流速度正相关的一对新橘霉素类代谢产物。最终，通过质谱导向的追踪分离成功发现了一个结构高度氧化的新骨架类型抗生素。这一新结构具有比生合成前体橘霉素更强的抗绿脓杆菌活性，说明其可能为菌种间竞争过程中真菌化学防御机制的反应产物。