朱砂叶螨对甲氰菊酯对映体代谢差异及对映体代谢抗性形成机制

The increased capability to metabolize acaricides is a vital mechanism of Tetranychus cinnabarinus resistance. At present, the commercial fenpropathrin is racemate with R-fenpropathrin and S-fenpropathrin at ratio of 1:1, thus all the obtained resistance mechanisms of fenpropathrin are the combined effects of R-fenpropathrin and S-fenpropathrin. However, few studies have been conducted to investigate the metabolic differences of fenpropathrin enantiomers as well as the relationship between enantioselective metabolism and the development of enantiomer metabolic resistance. Our previous study revealed the toxicity of R-fenpropathrin and S-fenpropathrin to T. cinnabarinus is significantly different. Therefore, this proposal will treat R-fenpropathrin and S-fenpropathrin as two different compounds and investigate the sensitivity difference and evolution rate of resistance difference of T. cinnabarinus to R-fenpropathrin and S-fenpropathrin, individually. Secondly, the structures of fenpropathrin enantiomer metabolites will be identified based on LC-QTOF and LC-MS/MS methods. The metabolites, metabolic pathways and pharmacokinetics parameters differences will compared between R-fenpropathrin and S-fenpropathrin. In addition, the key detoxifying enzymes that involved in fenpropathrin metabolism in T. cinnabarinus will be identified through enzyme inhibition study. Lastly, the differential gene expression will be compared with RNA-Seq deep sequencing and digital gene expression after S-fenpropathrin and R-fenpropathrin stress individually. Furthermore, the relationship between metabolic enzyme activity and evolution of resistance will also be identified after fenpropathrin enantiomer stress. Combining all the mentioned research results, the metabolic differences and enantioselective evolution of metabolic resistance in T. cinnabarinus will be clarified at enantiomer level. Such results will contribute to clarifying the metabolic resistance mechanism of T. cinnabarinus and providing a scientific basis for T. cinnabarinus resistance risk assessment and resistance management.

朱砂叶螨对杀螨剂代谢能力增强是其产生抗药性的重要机制。目前商品化甲氰菊酯都是以外消旋体的形式存在（R-甲氰菊酯：S-甲氰菊酯为1:1），因此得到的抗性机制都是两个对映体共同作用的结果。而有关朱砂叶螨对甲氰菊酯不同对映体代谢行为差异以及代谢差异与代谢抗性形成机制并不清楚。鉴于此，本项目在前期已证实甲氰菊酯对映体对朱砂叶螨毒力显著差异的基础上，将对映体区别对待，系统研究朱砂叶螨对甲氰菊酯不同对映体敏感性及抗性进化速率差异；结合质谱分析，明确对映体在朱砂叶螨中代谢物、代谢途径及酶代动力学差异，并确定参与对映体解毒代谢的关键酶；最后探明不同对映体胁迫后朱砂叶螨代谢抗性相关基因表达差异及代谢酶活性变化与抗性形成的关系。最终从对映体的独特视角阐明朱砂叶螨对甲氰菊酯对映体代谢差异及对映体代谢抗性形成机制，为全面了解和评估手性杀螨剂抗性风险、制订完善的抗性风险评估方案和正确的抗性治理策略提供科学依据。

农业上对朱砂叶螨的防治主要以化学杀螨剂为主，由于朱砂叶螨具有世代周期短，繁殖能力强，孤雌生殖等特点，导致该螨对杀螨剂抗性发展十分迅速。其中朱砂叶螨对杀螨剂代谢能力增强是其产生抗药性的重要机制。目前商品化甲氰菊酯都是以外消旋体的形式存在（R-甲氰菊酯：S-甲氰菊酯为1:1），因此得到的抗性机制都是两个对映体共同作用的结果。而有关朱砂叶螨对甲氰菊酯不同对映体代谢行为差异以及代谢差异与代谢抗性形成机制并不清楚。基于以上研究背景，本项目从对映体的独特视角，以期阐明朱砂叶螨对甲氰菊酯对映体代谢差异及对映体代谢抗性形成机制为目标，进行了系统深入的研究，取得了如下研究结果。.1..朱砂叶螨对甲氰菊酯对映体的敏感性差异及参与甲氰菊酯代谢的酶系鉴定. 朱砂叶螨生测结果表明甲氰菊酯对映体对朱砂叶螨的毒力存在显著差异，S-甲氰菊酯为高效体，R-甲氰菊酯为无效体；增效剂实验表明朱砂叶螨中参与甲氰菊酯代谢的酶系为羧酸酯酶（CarE）和细胞色素P450酶（P450），其中CarEs是主要代谢酶系。.2..甲氰菊酯不同对映体诱导后朱砂叶螨代谢酶基因表达差异研究.转录组测序以及定量结果表明朱砂叶螨中响应S-甲氰菊酯和R-甲氰菊酯诱导的代谢酶基因表达存在显著差异。同时结合朱砂叶螨甲氰菊酯抗性品系代谢酶基因表达结果分析，甲氰菊酯对映体诱导能促进朱砂叶螨甲氰菊酯相关抗性基因表达量的升高，同时相关抗性基因对甲氰菊酯不同对映体响应的程度不同，暗示朱砂叶螨对甲氰菊酯不同对映体产生不同的抗性。.3..朱砂叶螨关键代谢酶基因TcCCE06筛选和原核表达研究.基于TcCCE06基因在转录组中上调表达，同时在R-甲氰菊酯和S-甲氰菊酯诱导后显著上调表达，表明TcCCE06可能是朱砂叶螨中代谢甲氰菊酯对映体的关键基因；克隆获得朱砂叶螨的TcCCE06酯酶基因并利用原核表达技术获得TcCCE06基因的重组蛋白。.4..朱砂叶螨TcCCE06重组蛋白对甲氰菊酯对映体代谢差异研究.代谢实验表明，TcCCE06重组蛋白可以代谢甲氰菊酯的两个对映体，且对R-甲氰菊酯的代谢速率快于S-甲氰菊酯。在4h内，分别代谢掉32.1%的R-甲氰菊酯和13.8%的S-甲氰菊酯，表明TcCCE06蛋白对甲氰菊酯对映体的代谢存在显著差异。从代谢层面暗示朱砂叶螨对甲氰菊酯不同对映体产生不同的抗性。