长松萝中松萝酸生物合成的聚酮合酶基因克隆与鉴定

Usnic acid is unique lichen product，which has antibacterial, antivirus, anticancer character, and is applied to medicine, toothpaste and cosmetic industry. Usnic acid has important economic value. However, usnic acid biosynthesis genes are still unclear so far. The polyketide synthase related with usnic acid biosynthesis was not cloned, although it has been confirmed that usnic acid was synthesized by polyketide pathway. My preliminary study found that the culture condition and content of medium will influence product of usnic acid in Usnea longissima lichen forming fungus. Transcriptome of U longissima lichen forming fungus had been sequenced by Illumina sequencing when it produces usnic acid, In this project, Usnea longissima lichen forming fungus was took as the research object, the putative PKS genes related with usnic acid biosynthesis was deduced based on known transcriptome data. And then RT-PCR and HPLC were used to evaluate the relevance between these putative genes expression and usnic acid product. Finally, gene functions were confirmed by heterologous expression in Aspergillus nidulans. Our research will provide theoretical basis and technological support for obtaining usnic acid high yield strain and large scale commercial application of lichen product.

松萝酸是地衣产生的独特化合物，具有抗菌，抗病毒以及抗肿瘤活性，广泛应用于医药，牙膏及化妆品产业，具有重要的经济价值。然而，目前虽已确认松萝酸是通过聚酮合酶途径合成，但参与的相关基因并不清楚，也没有克隆得到参与松萝酸生物合成的聚酮合酶。申请人前期研究发现培养条件和培养基会影响长松萝地衣型真菌中松萝酸的合成，并利用高通量测序技术完成了其产生松萝酸时期的转录组测序。本项目拟以长松萝地衣型真菌为研究对象，依据前期得到的转录组数据，分析获得与松萝酸生物合成可能相关的聚酮合酶。然后，以荧光定量PCR和高效液相色谱检测在不同培养条件下相关基因的表达与松萝酸的产量，通过关联分析确认参与松萝酸合成的目标基因。最后，将目标基因在构巢曲霉中进行异源表达，确认基因功能。本研究有望从基因水平揭示松萝酸生物合成途径，为获得松萝酸高产菌株奠定基础，并为大规模商业利用地衣产物提供理论依据。

地衣具有巨大的药用价值，但地衣生长缓慢的特性限制了对地衣资源的开发利用。利用异源表达获得地衣产物成为开发利用地衣活性化合物的重要方式。而确定参与地衣活性化合物生物合成的相关基因成为关键的第一步。松萝酸是地衣产生的独特化合物，具有广泛的药用价值。本项目基于转录组分析首先获得可能参与松萝酸生物合成的聚酮合酶基因，然后利用荧光定量PCR检测地衣型真菌中聚酮合酶在不同培养基中的表达，同时检测不同培养基中松萝酸的含量。荧光定量PCR显示不同培养基会影响聚酮合酶的表达，同时不同培养基也影响松萝酸的含量。通过关联分析确定参与松萝酸生物合成的聚酮合酶基因。在获得参与松萝酸生物合成聚酮合酶基因后，我们用了pNQ-ArgB-Tj2 和PUC-yA-ΔnkuA两种构巢曲霉异源表达系统对获得的聚酮合酶基因进行异源表达。同时研发利用无缝连接技术构建PUC-yA-PKS异源表达载体以及利用鸡尾酒酶解法获得构巢曲霉原生质体的方法。实验结果显示pNQ-ArgB-Tj2异源表达体系由于外源基因是随机整合到宿主DNA中，由于聚酮合酶都是大片段DNA,因此，在筛选拥有完整表达元件的转化子比较困难，同时，由于随机整合获得的转化子中，外源基因的遗传背景也不一致，最终导致产物检测时面临巨大困难。PUC-yA-ΔnkuA由于是将外源基因直接替换yA基因簇，因此转化子中外源基因遗传背景一致，并且转化效率高。最终通过筛选转化子发酵条件，在发酵液中检测得到松萝酸。从而证实获得的聚酮合酶参与松萝酸的生物合成。本项目为开发利用地衣基因资源奠定重要理论基础，同时，也为真菌聚酮合酶异源表达提供参考。