苯丙噻重氮（ASM）在马铃薯块茎快速愈伤中的作用机理研究

In response to wounding, potato tubers generate a large number of reactive oxygen species (ROS). H2O2 at low concentration serves as a signaling molecule for up-regulating a series of defense-related genes. Phenylpropanoid metabolism supply phenolic precursors for wound healing of potato tuber, and energy is required for activation of phenylpropanoid metabolism. Our previous results showed that acibenzolar-S-methyl (ASM) treatment significantly shorted the duration for wound healing in tubers. However, the changes of ROS, energy supply and phenylpropanoid metabolism treated with ASM remain unknown, and the relationship among them need to be researched in systemic and in-depth. In this proposal, potato tubers are chosen as materials, and multidisciplinary approaches involving the physiological and biochemistry, cell biology and molecular biology, with the aid of modern analyzed methods such as transmission electron microscopy (TEM), epi?uorescence microscopy, high performance liquid chromatography (HPLC), proteomics analysis, and Western blot, the research is conducted to analysize the changes of activities of enzymes and metabolites related to ROS generation and scavenging, energy supply and phenylpropanoid metabolism in tubers treated with ASM at the subcellular, biochemistry, and molecular level. The results will elucidate complex relationships of ROS, energy and phenylpropanoid metabolism during wound healing, and also provide theoretical basis for further understanding mechanism of wound healing in potato tubers promoted by ASM.

马铃薯块茎损伤后会在短期内产生大量的活性氧（ROS），低浓度的H202作为信号分子可诱导一系列防御基因的表达。苯丙烷代谢为马铃薯块茎愈伤提供酚前体，而苯丙烷代谢的活化则需要能量的供应。我们前期研究发现ASM处理可以明显缩短马铃薯块茎的愈伤时间，但是，ASM处理后块茎体内的活性氧、能量供应及苯丙烷代谢如何变化，三者之间存在何种关系尚缺乏系统而又深入的研究。本项目拟以马铃薯块茎为试材，综合生理生化、细胞生物学和分子生物学等多学科方法，利用透射电子显微镜（TEM）、落视荧光显微镜、HPLC、蛋白组学分析及Western blot等技术手段，在亚细胞、生化和分子水平上解析ASM在促进马铃薯块茎快速愈伤过程中ROS的产生与清除，能量供应与苯丙烷代谢相关酶及产物的变化规律，以阐明ROS与能量、苯丙烷代谢之间的关系，为揭示ASM促进马铃薯块茎快速愈伤的作用机理提供理论依据。

愈伤是马铃薯块茎受损后的典型反应，在减轻块茎采后病害方面发挥了重要作用。但块茎完全愈伤所需时间较长，有必要采取措施促进愈伤。我们前期研究发现ASM处理可以明显缩短马铃薯块茎的愈伤时间，但其机理尚不清楚。本项目以‘陇薯3号’为试材，采用100mg/L的ASM对人工损伤的块茎进行处理，并结合质膜过氧化氢阻断剂DPI处理，通过荧光显微镜观察愈伤组织中软木脂的动态变化，并利用TEM、HPLC及蛋白组学等技术手段，在亚细胞、生化和分子水平上研究处理后块茎快速愈伤过程中ROS的产生与清除，能量供应与苯丙烷代谢相关酶及产物的变化规律，为揭示ASM促进马铃薯块茎快速愈伤的作用机理提供理论依据。结果表明：（1）ASM处理加速了软木脂的积累，维持了较低的失重率，还有效抑制了块茎愈伤过程中接种F.sulphureum的发病率和病情指数。结合DPI处理削弱了ASM所诱导的愈伤效果；（2）ASM处理增强了块茎愈伤组织中NADPH氧化酶（NOX）和超氧化物歧化酶（SOD）活性，进而促进了O2。-和H2O2的积累，结合DPI处理能够显著抑制由ASM诱导的NOX和SOD的活性，降低块茎愈伤组织中ROS的积累；（3）ASM处理提高了损伤块茎6-磷酸-葡糖糖脱氢酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（6-P-GDH和G-6-PDH）联合酶、磷酸己糖异构酶（PGI）、琥珀酸脱氢酶（SDH）、细胞色素C氧化酶（CCO）的活性及线粒体H+-ATPase和Ca2+-ATPase的活性，降低了电子传递链上NAD 的含量，增加了 NADP 的含量。愈伤后期，处理者ATP及能荷高于对照。此外，ASM处理组块茎愈伤组织中的线粒体数量显著多于对照，且线粒体形态和结构完好；（4）ASM处理有效提高了愈伤组织中苯丙氨酸解氨酶（PAL）、肉桂酸-3-羟化酶（C3H）、肉桂酸-4 - 羟化酶（C4H）、4-香豆酰-辅酶A连接酶（4CL）、阿魏酸 5-羟化酶（F5H）和肉桂酰乙醇脱氢酶（CAD）等苯丙烷代谢途径关键酶活性，同时促进了代谢产物肉桂酸，咖啡酸， P-香豆酸、阿魏酸和木质素的积累。结合DPI处理后PAL、4CL、C4H 和CAD等苯丙烷代谢酶活性明显低于ASM处理组。综上所述，ASM 对马铃薯块茎愈伤的促进作用与其诱导 ROS 的积累和增强能量及苯丙烷代谢密切相关，且 ROS 在 ASM 所诱导的苯丙烷代谢增强中起着重要作用。