地衣独特化合物β苔色酸生物合成基因鉴定及功能分析

β-orsellinic acid is unique lichen product, and also is an important precursor of depside with antibacterial, anticancer bioactive. Although putative non-reducing polyketide synthase with methyltransferase domain (MT-NRPKS) is supposed to involve in the biosynthesis of β-orsellinic acid , the polyketide synthase related withβ-orsellinic acid biosynthesis was not cloned, and the mechanism of methylation of β-orsellinic acid is still unclear. My preliminary study found that different medium would influence the product of β-orsellinic acid in Ramalina peruviana lichen forming fungi, and draft genome sequence of Ramalina peruviana lichen forming fungi had been finished. In this project, First, the putative MT-NRPKS genes related with β-orsellinic acid biosynthesis is deduced based on known genome data. And then, MT-NRPKS and its gene cluster involved in β-orsellinic acid biosynthesis are confirmed by evaluation of the relevance between these putative genes expression and β-orsellinic acid product, and Aspergillus nidulans （nkuAΔ）heterologous expression system. Finally, enzyme activity conservative sites of methyltransferase domain in MT-NRPKS are confirmed by PCR mutation of putative conservative sites. Our research will reveal the mechanism of β-orsellinic acid and its derivative biosynthesis, provide theoretical basis for obtaining large scale lichen product and new polyketide by fermentation.

β苔色酸是地衣产生的独特化合物，也是具有抗菌，抗癌活性的缩酚酸类化合物的重要前体。虽然目前推测其生物合成由含有甲基转移酶结构域的非还原型聚酮合酶(MT-NRPKS）完成，但是并没有克隆获得相关基因，对其苯环上的甲基化机理也不清楚。申请人前期研究发现不同培养基会影响地衣型真菌Ramalina peruviana中β苔色酸的合成，并完成基因组测序。本项目拟首先通过基因组分析获得MT-NRPKS基因；然后，通过基因表达与β苔色酸产量的关联分析确认参与β苔色酸生物合成的 MT-NRPKS及基因簇；并利用构巢曲霉（nkuAΔ）异源表达系统对获得的MT-NRPKS及基因簇进行功能验证。最后，利用PCR突变法对潜在酶活性保守位点进行突变确定MT-NRPKS中甲基转移酶的酶活性保守位点。本研究有望全面揭示β苔色酸及其衍生物的生物合成机理，为大规模发酵获得地衣产物以及新的聚酮化合物奠定基础。

地衣具有巨大的药用开发价值，但地衣生长缓慢的特性严重限制对地衣活性化合物的开发利用。β苔色酸是地衣产生的独特化合物，也是具有抗菌，抗癌活性的缩酚酸类化合物的重要前体。本项目首先通过对Ramalina peruviana基因组进行分析获得3个含有甲基转移酶（MT）的非还原聚酮合酶基因（NRPKS）。然后，通过基因表达与β苔色酸产量的关联分析确认参与β苔色酸生物合成的PKS基因及基因簇，为进一步确定参与β苔色酸合成的基因簇，我们对19种地衣型真菌基因组进行比较分析，确定β苔色酸基因簇的结构组成。同时，通过多重比较β苔色酸和苔色酸聚酮合酶基因，分析β苔色酸聚酮合酶MT-NRPKS中甲基转移酶的保守区域。随后，构建yA-NRPKS-PUC, yA-NRPKS-P450a-PUC,yA-NRPKS-P450b-PUC,yA-NRPKS-P450a-P450b-PUC,yA-P450a-PUC, yA-P450b-PUC载体。并将这些表达元件导入构巢曲霉中。同时，我们将去除MT的β苔色酸聚酮合酶（ΔMTPKS）和苔色酸聚酮合酶基因（ORA）分别导入构巢曲霉中。对这些转化子进行DNA水平，RNA水平，筛选获得正确的转化子，进行后续发酵实验。对NRPKS，NRPKS-P450a，NRPKS-P450b转化子的发酵粗提物进行LCMS-IT-TOF检测发现有新的聚酮化合物产生。但对单独的P450a，P450b异源表达的转化子发酵产物检测中没有发现新的化合物。对去除MT的β苔色酸聚酮合酶和苔色酸聚酮合酶基因的转化子发酵产物LCMS-IT-TOF检测发现含有苔色酸聚酮合酶基因的转化子能够产生苔色酸，而去除MT的β苔色酸聚酮合酶基因的转化子并没有检测到苔色酸或者新的聚酮化合物。随后，我们主要对ORA以及LCMS-IT-TOF检测有新的聚酮化合物的转化子进行发酵条件优化。通过在ORA转化子培养基中添加乙酸盐明显增加产物的含量，最终获得苔色酸含量高达0.5g/L的发酵液。而对β苔色酸及基因簇的转化子培养条件优化并没有明显效果。最终我们通过与β苔色酸衍生物atranorin标准品进行比较，确定转化子NRPKS-P450a-P450b发酵液中含有atranorin，但由于时间有限，我们并没有分离得到atranorin单体化合物。本研究成功分离获得苔色酸单体化合物，并且发现通过添加前体方式可以增加目标