盐桥在P2X受体门控过程中的重要作用

The salt-bridge, formed by acidic and alkaline amino acids in space of biological macromolecules，plays diverse important roles in enzymes, receptors and other bio-active proteins. Previous researches of us and research groups abroad reported that salt-bridges mediate functions such as gating and membrane surface expression in various ion channels. P2X receptors, which are considered to be a promising target for drug development, are extensively expressed in central and peripheral tissues and organs, and involved in the physiological and pathological processes of pain sensation and cardiovascular, respiratory, gastrointestinal, urinary systems, etc. The crystal structure resolution of P2X has laid a solid foundation for the study of the structure and function relationship of the channel. We have identified pairs of highly conserved salt-bridges with their functions remained unclear. In this project, by combination of site mutation, electrophysiology, chemical modification, molecular simulation in complex system and other biochemical and molecular approaches, we intend to screen the salt-bridges to identify those with important functions; and to compare the similarities and differences of functions between the various salt-bridges in different subtypes of P2X family, and to explore the significance for their structural conservatism or diversity during evolution; therefore, to get to understand the basic principle of the receptors involved in nerve signal transmission, and to provide structural foundation for the development of new drugs.

在生物大分子中，由酸性和碱性氨基酸在空间上组成的盐桥结构在各种酶类、受体及其他活性蛋白中发挥诸多重要的功能。国外的课题组及申请人在以往的研究中发现，盐桥在不同种类的离子通道中介导了门控及膜上分布等多种作用。P2X受体广泛分布于外周和中枢中，并参与痛、心血管、呼吸、胃肠、泌尿等生理和病理过程，作为新药研发靶标而备受关注。其晶体结构的解析为研究通道的结构和功能关系打下了坚实的基础。申请人发现P2X受体有多对高度保守性的盐桥，但其功能并不十分明确。本项目拟结合点突变、电生理、化学修饰、复杂体系分子模拟及其它分子生化等多种手段开展针对P2X盐桥涉及功能的筛选研究，鉴定对P2X受体有重要功能的盐桥结构；并比较P2X家族各个亚型之间盐桥功能的异同，探索其在进化上结构保守或不保守的原因和意义；以期深入了解该受体参与神经信号传递的基本工作原理，为新药研发提供结构基础。

生物大分子中的盐桥结构在各种受体及其他活性蛋白中发挥诸多重要的功能。在以往的研究中发现，盐桥在不同种类的离子通道中介导了门控及膜上分布等多种功能。本项目研究对象是P2X受体，其参与痛、心血管、呼吸、胃肠、泌尿等多种生理和病理过程，尤其其多个晶体结构的解析结果为我们提供了P2X受体更为具体和丰富的信息，便于我们对其结构和功能进行更深入的探索。我们通过结合多种手段，包括分子生物学，电生理，化学修饰，分子动力学模拟，western等方法，筛选出了与重要膜受体P2X4激活过程中发挥重要作用的盐桥, 分别是R309...D85，R278...D280，以及K329...E56...K197并研究了它们的作用机制。其中，我们发现盐桥R309...D85作为一个多区域的支点，可以使蛋白稳定在正常的构象，支点一旦被破坏，导致与β2,3作用的各个区域发生变化，最终导致蛋白的不稳定以及门控受到影响。该工作已发表在J Biol Chem (2016)。在P2X4中我们还发现另一对重要的盐桥R278...D280，该盐桥的相互作用对于P2X4开放态LF区域的压缩/刚性行为是至关重要的。该工作已经发表于J Biol Chem (2017)。另外，我们最新研究还发现细胞外Ca2+可通过与post-TM1和pre-TM2的氨基酸之间形成的盐桥相互作用对P2X4产生变构抑制，该变构抑制与酒精和Ivermectin（IVM）对P2X4的作用密切相关（in submission）。由于P2X受体是具有潜力的多种生理和病理过程的药物靶标，这些重要位点的发现为其激活失活机制的提供了重要内容，并为P2X相关疾病的干预提供了全新线索。