油茶DGAT基因对种子含油率和脂肪酸组成的影响

油茶是我国重要的木本油料树种，茶油品质优良。油茶种子含油率较低，提高油茶种子的含油率是油茶育种的重大目标。三酰甘油（Triacylglycerols，TAG）是茶油的主要成分，而 DGAT酶是TAG合成的Kennedy途径中唯一的限速酶，因此直接影响TAG的累积。本项目在获得38个油茶无性系种子含油率、脂肪酸组成的基础上，拟从不同含油率的无性系中克隆DGAT基因，分析其多态性对种子含油率和脂肪酸组成的影响，利用关联分析鉴定起决定作用的差异位点；通过实时荧光定量PCR，研究油茶DGAT基因在不同梯度含油率无性系种子不同发育时期的表达模式，阐明DGAT基因对油茶种子含油率和脂肪酸组成的贡献；通过转基因拟南芥，研究油茶DGAT基因的过量表达能否通过提高TAG的含量而提高种子含油率，并改善脂肪酸的组成。研究结果将为通过分子手段培育高含油率的油茶新品种提供重要的理论基础和技术支撑。

油茶是我国重要的木本食用油料树种，茶油品质油料，但产量较低；针对此，本项目选择油脂合成的一个关键基因DGAT1，开展了系统研究，明确了油茶DGAT1基因可以显著提高种子含油率。研究结果为揭示油脂合成的分子调控具有重要科学意义，也为实现油茶定向分子育种奠定了重要科学基础。主要研究结果如下：（1）油茶DGAT1基因的克隆。以油茶良种‘华硕’发育中种子为材料，采用Illumina Hiseq 2000高通量测序平台技术进行转录组测序，获得65,536条Unigene，并发现2个DGAT1片段，氨基酸序列为240个氨基酸。基于此，利用RACE技术，克隆了油茶DGAT1基因的全长cDNA序列，长度为1893bp，包含1个1548bp的开放阅读框，编码515个氨基酸，5'UTR和3'UTR区分别为121bp和229bp。编码蛋白分子量为58.44 k Da。（2）油茶DGAT1基因的特征分析。通过Southern杂交检测基因组中仅含一个DGAT1拷贝；用基因枪法轰击洋葱表皮，确定该基因是在细胞膜和细胞质中表达。构建原核表达载体pET-30a-CoDGAT1，在加入1.0MIPTG，诱导1-4小时时，成功在大肠杆菌中成功表达CoDGAT1蛋白。（3）油茶DGAT1基因的表达及与油脂合成的关联分析。以筛选到的EF1a基因作为内参，研究了油茶DGAT1基因的表达模式。该基因在种子发育过程中有两个表达高峰期，分别是油脂合成初始期表达量的13倍和11倍；同一时期的花组织各部分表达量差异不显著（P＜0.05）；CoDGAT1的表达与油脂含量的关联度高达0.9494，证明DGAT1在油脂积累过程中起着重要作用。（4）油茶转基因拟南芥和烟草的功能解析。在野生型拟南芥中过量表达DGAT1基因，含油率提高9%，脂肪酸组成有改变，但不显著；转基因烟草中种子含油率提高3.5%，脂肪酸组成有改变，但不显著。可见，油茶DGAT1基因可以显著提高种子的含油率，但不能显著改变脂肪酸组成。（5）油茶DGAT2基因的克隆和基于油脂合成基因的标记开发。采用同源克隆方法获得了油茶CoDGAT2序列的全长cDNA，长度为1271bp，包含1002bp的开放可读框，编码333个氨基酸。基于转录组数据中的油脂合成基因，选择179个位点，开发了67个多态性标记，为鉴定油脂合成连锁的分子标记奠定了重要基础。