水杨酸对微拟球藻大洋种温度抗逆性的影响及其机理研究

Since marine microalgae is of tremendous potential for application, it’s an irresistible trend to vigorously develop microalgal cultivation. However, temperature is one of the major limiting factors in its development. Salicylic acid can improve the temperature tolerance capacity of many plant, but the mechanism of this induction remain unclear. Therefore, it’s necessary to carry out research on the mechanism of impact of salicylic acid on temperature resistance. Nannochloropsis sp., featuring available genetic manipulation tools and abundant basic data, gradually becomes model microalgae. Industrial cultivation of N. oceanica is generally subject to temperature, but my previous researches indicated that salicylic acid can boost its temperature resistance. This project intends to shed light on the mechanism of improving microalgal temperature resistance by salicylic acid. Firstly, the impact of salicylic acid on resistance of N. oceanica under low and high temperature is determined. Secondly, we analyze the differences in gene expression by comparing transcriptome sequencing results under different treatments and mainly focus on salicylic acid resistance-related genes to illustrate the mechanism and screen the key genes of improving temperature resistance. Important keys are finally verified by real-time quantitative PCR and in vivo transformation. The project, with better feasibility and scientific significance, will provide a theoretical basis for optimizing microalgal cultivation and genetic improvement, which will give important reference to other microalgal industry subject to temperature as well.

海洋微藻开发潜力巨大，大力发展海洋微藻产业化养殖是必然趋势，但温度是其发展的主要限制因素之一。水杨酸可提高植物抗温度胁迫的能力，但其诱导植物温度抗逆性的机制尚不清晰。因此，开展水杨酸对微藻温度抗逆性影响机制的研究十分必要。微拟球藻遗传操作工具齐备，基础数据丰富，逐步成为模式微藻。该藻产业化养殖受制于温度，而申请人研究发现水杨酸恰能提高其温度抗逆性。本项目以微拟球藻作为研究对象，拟阐明水杨酸提高其温度抗逆性的机制。首先，分别探索水杨酸对低温和高温胁迫下微拟球藻抗逆生理的影响。其次，通过转录组测序比较不同处理下基因表达差异，重点分析水杨酸代谢途径和抗逆相关基因，廓清水杨酸响应机制并筛选提高温度抗逆性的关键基因。最后，利用实时定量PCR和微拟球藻转基因手段验证重要关键基因。该项目将为该藻的优化培养与遗传改良提供理论依据，具有较好的可行性和科学意义；亦可为其它受限于温度的微藻产业发展提供重要参考。

微拟球藻是一类具有巨大开发潜力的经济微藻，其规模化养殖多以室外跑道池为主。温度成为影响微拟球藻产量和品质的主要限制性因素之一。本研究对常温下培养至对数生长中期的微拟球藻分别给予低温和高温胁迫处理，进而监测其生长及抗逆相关生理指标。结果表明，外源水杨酸能够促进低温和高温胁迫下微拟球藻的生长，并使其可溶性糖、可溶性蛋白等含量显著提高，丙二醛含量显著下降，不饱和脂肪酸相对百分含量显著增加，并以15 mg/L效果最佳。通过荧光定量PCR手段，进一步分析发现水杨酸促进了Δ5和Δ6去饱和酶基因转录，但并未明显促进Δ12去饱和酶基因转录。利用转录组测序技术，进一步比较分析处理组和对照组（高温+SA，高温+不加SA，低温+SA，低温+不加SA，常温+不加SA）微拟球藻中差异表达基因情况。分析得知，常温和低温组相比，差异基因分布最多的是生物过程相关基因；常温和高温组相比，分布最多的是生物过程和细胞组成相关基因。针对响应微拟球藻抗温度逆境胁迫的关键基因之一Δ9去饱和酶基因，克隆得到其基因全长并利用体外验证体系对其进行功能验证。得知该基因无内含子，ORF序列全长1080bp，相对分子量质量为41.04，等电点为9.12，具有2个明显的跨膜区。蛋白序列分析显示，该基因N端无信号肽序列，具有3个保守的组氨酸簇，表明基因属于“第一”去饱和酶家族。通过亚细胞定位，确定其定位于叶绿体基质，N端有一小段包含31个氨基酸的叶绿体转运肽。体外功能验证表明，Δ9去饱和酶能催化硬脂酸去饱和生成油酸。因此，推测NOfad9编码的蛋白有Δ9去饱和酶的催化功能。此外，本实验采用实时定量PCR和气相质谱联用(GC-MS)的方法，探究不同生长期微拟球藻中Δ9去饱和酶基因的转录水平差异及其与单不饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸含量变化的相关性。本研究为微拟球藻的优化培养与抗逆研究提供了理论依据，具有重要的理论意义和经济价值。