解淀粉芽孢杆菌高效表达体系的建立及其高效表达机制的初步研究

As the producer of many important industrial enzymes, Bacillus amyloliquefaciens has the strong ability of protein secretion. It also exhibits excellent prospects as heterologous host to express feeding enzymes with high efficiency. However, the application of B. amyloliquefaciens as heterologous expression host is severely limited by several factors, e.g., presence of restriction and modification system, poor plasmid stability, lack of expression elements and high activity of endogenous proteases. The previous study of the applicant had been given a good solution to the problem of poor genetic transformation and plasmid stability in Bacillus amyloliquefaciens K11 strain. In this project, we aim to establish the highly effective expression system of Bacillus amyloliquefaciens with good commonality, high stability and high-yield secretion, by knocking out the main protease gene of strain K11, screening of high expression elements, e.g., strong promoters and signal peptides from highly productive Bacillus industrial strains that are suitable for expression in K11 strain. Furthermore, the mechanism that mediated highly-effective expression of foreign genes will also be explored on the molecular level. The project will offer new approach for efficient expression of more feeding enzyme preparations, and lay a good foundation for its deep research on mechanism of highly-effective expression.

解淀粉芽孢杆菌是很多重要工业酶制剂的生产菌株，具有较强的蛋白分泌能力，其在作为异源宿主进行饲用酶制剂的高效表达方面具有巨大的发展前景。然而，解淀粉芽孢杆菌中存在的限制修饰系统、质粒稳定性差、表达元件缺乏以及内源蛋白酶活力高等问题严重限制了其在基因工程研究中的广泛应用。申请人前期的研究已较好的解决了解淀粉芽孢杆菌K11遗传转化难和质粒稳定性差的难题，本项目拟在将K11菌株中的主效蛋白酶基因进行敲除，以降低对外源蛋白降解的基础上，从高产酶蛋白的芽孢杆菌工业生产菌株中筛选能够引导外源基因在K11菌株中高效表达的强启动子、高效分泌信号肽等分泌表达元件，并从分子水平上对介导外源基因在K11中进行高效表达的机制进行初步研究，以此建立通用性好、稳定性强、分泌量大的解淀粉芽孢杆菌高效表达系统。本项目将为更多饲用酶制剂的高效表达提供新的途径，同时也为其高效表达机制的深入研究奠定理论基础。

解淀粉芽孢杆菌K11（B. amyloliquefaciens K11）是一株高产中性蛋白酶和角蛋白酶的菌株，能够稳定的生产重组蛋白及进行酶蛋白的高密度发酵。本项目以解淀粉芽孢杆菌K11为宿主菌、克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶基因BcaprE作为报告基因，通过高产酶蛋白的工业菌株的强启动子（PamyQ、PaprE、Pnpr）和高效分泌信号肽（SPamyQ、SPaprE、SPnpr）的优化组合，筛选适用于K11菌株高效分泌表达外源蛋白的通用表达元件。摇瓶测试结果显示：在以α-淀粉酶基因启动子PamyQ、碱性蛋白酶基因信号肽SPaprE组成的表达元件调控下，碱性蛋白酶基因BcaprE在解淀粉芽孢杆菌K11中的胞外分泌表达水平为最高，可达13804 U/mL。该优化组合元件PamyQ-SPaprE，同样也能够有效的引导生麦芽糖淀粉酶基因Gs-MAase（19.0 U/mL）和中性蛋白酶基因Banpr（17000 U/mL）的高效分泌表达。通过敲除K11菌株的内源蛋白酶基因Banpr，碱性蛋白酶BcaprE和生麦芽糖淀粉酶MAase在蛋白酶缺陷型突变株7-6中的表达水平分别提高了25.0%和19.4%。在15-L发酵罐水平上，碱性蛋白酶重组菌株QC-E分泌BcaprE的水平进一步提高到了30200 U/mL。通过易错PCR方法构建分泌表达盒随机突变文库，初步探讨了高效分泌表达元件所介导的高效分泌机制，同时获得了不同强度的解淀粉芽孢杆菌分泌表达盒文库。该项目所建立的以解淀粉芽孢杆菌7-6为宿主菌，不同丰度PamyQ-SPaprE为分泌表达盒所建立的解淀粉芽孢杆菌表达体系具有较好的通用性，可为更多酶制剂的高效表达提供新的途径，其成熟的发酵工艺条件对于重组酶制剂的工业化生产具有现实的应用指导意义。