EgTPx通过PI3K/Akt/mTOR通路调控肝脏区域巨噬细胞极化及在细粒棘球蚴致病机制中的作用

Echinococcosis is a serious zoonoses in northwest of China and more than 95% cases are cytic echinococcosis (CE), which caused by Echinococcus granulosus (E.g) infection. The pathogenic mechanism of E.g need to be clarified. Study on the secretion protein of E.g in regulating liver macrophage polarization which mediated host immune tolerance is rarely reported. In our previous study, we found larger macrophages infiltration around lesions in CE patients; E.g infection and key secreted protein TPx can induce macrophages to M2 polarization, and the key member Akt and mTOR of PI3K signaling pathway in M2 macrophage occur phosphorylation, suggesting that TPx may induce host immune tolerance by regulating macrophage polarization through the PI3K/Akt/mTOR signal pathway, but the mechanism is unknown. In this work, we plan to elucidate the effects of the key secreted protein EgTPx on macrophage polarization type and function influence through using the liver primary macrophages, E.g infection animal models and CE clinical specimens. Using EgTPx stimulation and the inhibitor of mTOR in liver macrophage cultivation system in vitro to identify the molecular mechanism of macrophage polarization. Secondly, establishing a E.g infection mice model, we elucidate the key role in immune tolerance of liver macrophages in E.g infection by way of reverse cell clearance and forward adoptive transfer. Finally, we explore the feasibility and effectiveness for CE treatment by inhibit liver macrophages toward to M2 polarization through using the EgTPx neutralizing antibody or mTOR inhibitor in the E.g infected mice model in vivo. These studies have important scientific significance to reveal the mechanism of growth, development and pathogenicity of E.g and to develop new drugs and new therapeutic method for CE.

囊型包虫病（CE）是我国西部危害严重的人畜共患病，几乎均原发于肝脏，至今无理想治疗手段。我们前期研究发现CE病灶周围巨噬细胞(Mφ)大量浸润，细粒棘球蚴（E.g）分泌蛋白EgTPx可诱导Mφ向M2型极化，且Mφ中PI3K通路成员Akt和mTOR发生磷酸化，推测EgTPx可能通过PI3K/Akt/mTOR信号通路调控肝脏Mφ向M2型极化造成E.g免疫逃逸，但机制不明。本项目拟利用肝脏原代Mφ系、E.g动物模型和CE临床标本三个层面确定EgTPx对Mφ极化和功能的影响，并通过正向激活和反向抑制方法阐明EgTPx调控Mφ极化的分子机制；其次采用细胞清除和过继转输方式，明确肝脏Mφ在E.g感染所致免疫耐受过程中的关键作用；最后使用EgTPx中和抗体或mTOR抑制剂干预E.g感染动物模型，探索抑制肝脏Mφ向M2型极化用于CE治疗的有效性，对揭示E.g致病机制、研制新型治疗药物和方法具有重要科学意义。

95%以上的包虫病例是由细粒棘球蚴（Echinococcus granulosus, E. g）感染所致的囊型包虫病（Cystis Echinococcosis, CE），危害严重，新疆是CE高发区。E.g感染诱导巨噬细胞M2型极化抑制宿主免疫应答促进寄生，但机制不明。本研究从细胞水平、动物模型和临床标本三个层面，采用正向激活和反向抑制等多种实验手段开展深入研究，阐明E.g感染调控巨噬细胞向M2型极化诱导免疫耐受的分子机制。取得的研究结果主要包括：首先，利用E.g腹腔感染小鼠模型以及虫体ES抗原和分泌蛋白EgTPx分别从体外、体内刺激小鼠腹腔巨噬细胞，发现E.g感染和分泌蛋白EgTPx通过激活PI3K/AKT/mTOR信号通路诱导巨噬细胞M2极化，利用抑制剂LY294002和雷帕霉素干预进一步明确EgTPx蛋白通过该通路调控巨噬细胞M2极化的分子机制。其次，成功建立E.g原头蚴经肝门静脉途径感染小鼠的囊型包虫病动物模型，能够更好地模拟临床表现，肝脏组织病理学检测发现感染早期病灶周围炎性细胞带中F4/80+巨噬细胞大量募集，利用流式细胞术进一步检测发现感染早期（2周）肝脏募集大量的单核来源巨噬细胞（MoMFs），主要为M1促炎表型，感染中晚期（12至24周）逐渐转化为M2抗炎表型优势，而肝脏驻留巨噬细胞亚群（KCs）在感染早、中、晚期主要为M2抗炎表型优势；通过氯膦酸盐脂质体分别在早期和晚期清除小鼠肝脏巨噬细胞，发现巨噬细胞清除后能够抑制肝脏纤维化，促进小鼠肝脏病灶的生长，表明巨噬细胞对E.g在宿主肝脏中的成功寄生至关重要；利用雷帕霉素抑制剂经腹腔注射治疗E.g感染小鼠模型，发现该抑制剂有一定的治疗效果。最后，利用CE患者肝脏手术标本，证实CE患者肝脏病灶周围巨噬细胞大量浸润，且高表达M2型巨噬细胞标志物；活性期CE患者炎性细胞浸润程度及巨噬细胞表达高于非活性期CE患者，表明肝脏巨噬细胞亚群与CE患者活性存在一定的关联性。本项目阐明了E.g关键分泌蛋白EgTPx通过PI3K/Akt/mTOR信号通路调控巨噬细胞M2型极化进而介导宿主免疫耐受促进寄生的分子致病机制，对揭示E.g与宿主的交互作用、研制新型药物、探索CE新的临床治疗方法均具有一定的科学意义。