细粒棘球蚴TPx基因的生物学功能鉴定和干预对其致病性的影响

Cystic echinococcosis (CE) is a cosmopolitan zoonosis caused by the larval stage of the cestode Echinococcus granulosus (Eg), which is hyper-endemic in western China. Given the parasite lives in an aerobic organism which produces a large amount of reactive oxygen species (ROS) around and larval cyst can be in host for up to 46 years, the parasite must produce antioxidants against ROS for survival. However, there are very limited studies on Eg anti-oxidative stress. We identified that about 40% of sera from CE patients had specific antibodies against Eg thioredoxin peroxidase (EgTPx), suggesting the enzyme is secreted or located in the outside of the parasite. I have cloned EgTPx and showed that the enzyme has high function to convert H2O2into H2O and O2. Given the parasite has very low activities of glutathione peroxidase (GPx) and catalase, TPx must play an important role in anti-oxidant system and in turn, play an important role for parasite survival and likely is the target for drug and vaccine development. In the present study, we aim (1) to explore the functional characterisation of EgTPx using H2O2tolerance bioassay and metal-catalyzed oxidation assay; (2) to identify the tolerance limit of protoscoleces (PSC) against H2O2 (3) to interpret the relationship of TPx and growth and survival of the parasite using an in vitro model and (4) to silence the EgTPx gene using RNAi to identify the role of this gene in parasite against H2O2.

细粒棘球蚴（Eg）感染所致的囊型包虫病（CE）是中国西部地区危害严重的一种人畜共患寄生虫病。Eg需要清除自身代谢和拮抗宿主免疫细胞产生的双重氧化损伤才能在宿主体内稳定寄生。针对Eg抗氧化应激系统的研究较少，研究表明硫氧还蛋白过氧化物酶(TPx)是其抵抗氧化损伤（分解过氧化氢H2O2）的关键抗氧化酶，可能对其在宿主体内的正常生长和存活十分必要。本研究拟利用毕赤酵母真核表达系统表达EgTPx蛋白，通过还原H2O2活性及保护超螺旋DNA等实验鉴定其生物学功能；使用不同浓度H2O2处理体外培养的原头蚴（PSC），通过观察PSC活性状态和EgTPx表达，确定PSC耐受H2O2的浓度及EgTPx对高氧环境的保护作用；利用RNAi 技术，通过体外（Eg体外培养体系）、体内（Eg感染小鼠模型）两方面相结合阐明EgTPx基因对细粒棘球蚴生长、存活及致病性的影响，为包虫病药物的筛选和研发提供思路和理论依据。

细粒棘球蚴（Eg）感染所致的囊型包虫病是中国西部地区危害严重的一种人畜共患寄生虫病。Eg需要清除自身代谢和拮抗宿主免疫细胞产生的双重氧化损伤才能在宿主体内稳定寄生。针对Eg抗氧化应激系统的研究较少，EgTPx是Eg抵抗氧化损伤的关键抗氧化酶，可能在宿主体内稳定寄生过程中发挥重要作用。为进一步阐明 EgTPx的生物学功能及其在Eg生长、发育和致病性中的作用，本课题通过克隆获得EgTPx基因，生物信息学分析显示该基因序列高度保守，具有典型的2-Cys型过氧化物氧还蛋白催化性位点，通过将催化性位点Cys突变成Gly，克隆获得了EgTPx的突变体，并利用大肠杆菌表达系统成功表达EgTPx及其突变体蛋白，金属催化氧化（MCO）系统和还原剂DTT实验证实重组蛋白EgTPx具有抗氧化活性，突变后活性丧失，氨基端的催化性位点Cys是其抗氧化特性的关键活性位点，并制备了高效价的鼠源和兔源 EgTPx多克隆抗体。同时利用毕赤酵母真核表达系统成功实现了EgTPx蛋白的分泌性表达，表达的 EgTPx蛋白具有分解H2O2的生物学功能，且具有良好的免疫原性。体外实验表明原头蚴耐受H2O2的最大浓度为0.6mM，且其表达受H2O2的诱导。本课题设计筛选得到了能够有效下调 EgTPx表达的 siRNA，通过电转途径可有效将外源dsRNA转入虫体，EgTPx基因表达下调后，虫体活力下降至40%；体内实验结果表明， Eg原头蚴EgTPx基因干扰后，小鼠的成囊率明显降低，宿主肝损伤减轻。此外，将重组EgTPx蛋白免疫小鼠，在产生高效价的EgTPx抗体基础上再建立Eg继发感染模型，发现小鼠的成囊率和囊重明显降低，表明EgTPx抗体可能是通过中和Eg分泌的EgTPx抗氧化物酶的活性，导致虫体抵抗氧化损伤能力降低，从而影响虫体在宿主体内的寄生生长，对囊型包虫病小鼠模型有一定的预防或治疗效果。本项目初步阐明了 EgTPx 的生物学功能及其在Eg生长发育中的作用，明确通过干扰EgTPx基因的表达能够明显降低Eg的致病性，为包虫病药物的筛选和研发、疫苗的研制以及临床治疗提供了思路和理论依据。