新型多肽及修饰体抗感染性HUS活性及其作用机制研究

感染性溶血性尿毒综合征(Haemolytic uraemic syndrome，HUS)是儿童急性肾衰竭的最主要原因，可导致5－10％病例死亡。志贺样毒素（Slt）是病原细菌重症感染诱发HUS的关键致病原，直接针对Slt的药物设计已被证实有效。本研究拟以前期生物文库筛选获得的抗Slt活性肽TF12，WA12（专利申请号CN200710064228.7）为基础，进行多肽结构修饰，分别通过线性肽化学基团修饰、多肽支链化及PEG化等，提高稳定性、结合效价和生理长效性；利用Slt的生物毒模型和小鼠感染性HUS模型，评价新型活性肽抗感染性HUS的效果，遴选肽抑制剂的优势结构；应用大鼠观察新型多肽清除体内病原毒素(Slt)的效果，并对多肽进行初步毒性研究。同时，运用毒素细胞互作模型和胞内转运模型，基于突变技术、流式细胞术、激光共聚焦、表面等离子共振技术等，在分子和细胞水平探讨新型活性肽的作用机制。

感染性溶血性尿毒综合征(Haemolytic uraemic syndrome，HUS)是儿童急性肾衰竭的最主要原因，可导致5－10％病例死亡。志贺样毒素（Slt）是病原细菌重症感染诱发HUS的关键致病原，直接针对Slt的药物设计已被证实有效。本研究以前期生物文库筛选获得的抗Slt活性肽为基础，进行多肽结构修饰，获得新型多肽NF12 (又名P1)。利用BIAcore SPR技术对多肽和重组Stx2 蛋白的特异结合活性进行动态分析，P1 与Stx2 结合能力高于其它的多肽，测得多肽P1 与Stx2 结合的亲和力常数 KD：1.25e-6。MTT法筛选多肽P1抑制Stx2 对HeLa细胞毒性作用，结果发现仍然是P1对Stx2 的细胞毒作用的抑制率高于其它的多肽。 P1：IC50为180 μM，相同浓度P1（300 μM）对Stx2（5×CD50）细胞毒作用的抑制率达82%。进一步，利用动物水平评价多肽的抗志贺毒素活性。（1）在BALB/c小鼠攻毒致死模型上的评价，采用先腹腔给予多肽，20min后10 LD50腹腔攻毒实验。多肽的剂量为22mg/kg时，保护小鼠存活率仍能达到70%。（2）在Wistar大鼠模型上的评价，实验采用绝对致死剂量毒素(≥1 MLD)和多肽混匀后立即尾静脉注射。当P1的剂量达到5.6mg/kg，可对受试大鼠提供100%保护。组织病理分析显示，多肽可以抑制毒素对小鼠、大鼠肾的靶器官损伤。进一步的毒素在大鼠体内的代谢与组织分布研究结果显示，多肽P1明显干预125I-Stx2在大鼠体内的代谢规律与组织分布水平，干预组和攻毒组相比：0-4h，P1明显降低了Stx2在大鼠血液中的浓度；72h检测，125I-Stx2 cpm值在大部分组织中下降，尤其在鼻甲骨，肾上腺降低尤其明显（P<0.05），靶器官肾中Stx2分布水平减低50%以上，表明多肽可以加快毒素在体内的清除。流式细胞术分析结果表明，新型多肽有阻断毒素与靶细胞表面的Gb3受体结合的功能，多肽P1（300 μmol/L）对FITC-Stx2BH与HeLa细胞结合的阻断率为45.7%。同时125I-Stx2结合并内化入HeLa细胞的实验，也发现相比较毒素孵育的细胞对照组，添加多肽可使结合并进入靶细胞的125I-Stx2水平明显降低，从另一个角度阐释多肽可阻抑125I-Stx2侵袭HeLa细胞的能力。