藏猪源解淀粉芽孢杆菌纤维素酶的异源高效表达与应用研究

Recently, some feedstuff, such as rapeseed meal and cottonseed meal, have been increasingly applied in feed manufacture for monogastric animals. However, due to the high fiber contents have are difficult to be digested in monogastric guts, we have to face to the fact that limited feed resource have been hugely wasted. Feed additives, cellulose, produced via bacteria/fungi fermentation, nowadays, are generally in low activities of fermentation and hydrolysis, which significantly limits its application in feed industry. Therefore, it is of importance to exploit a new source of cellulose and improve its activity. Cellulase is a collective term for three enzymes including endo-1,4--glucanase, exo-1,4--glucanase and -glucosidase. Their cooperation is necessarily required for a thorough hydrolysis of cellulose/fiber. The applicant’s research laboratory has successfully separated a cellulase with high performance from Bacillus amyloiliquefaciens from Tibet pig feces. Based on our previous researches, the project aims to investigate the composition of this cellulose and tis structure to clarify the catalytic mechanisms. We plan to develop an expression system for the production of each cellulose component, and optimize the fermentation condition. The project can not only solid cellulose functions in digest feed fibers, also its findings can recover a prospecting role of cellulose for the production of feed industry.

近年来，菜籽粕、棉籽粕等高纤维素原料越来越多的用于单胃动物饲料中，但由于纤维素含量高、单胃动物消化利用率低，造成了有限饲料资源的浪费。目前的产纤维素酶菌株发酵活力低、水解效率有限，限制了其在饲料工业中的应用，因此研制高水解活性纤维素酶产品具有非常重要的意义。纤维素酶是催化纤维素水解的一类酶的总称，包括外切-β-1,4-葡聚糖酶、内切-β-1,4-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶三个组分，纤维素的完全水解需要这三个组分的协同作用。申请人所在的实验室分离了一株藏猪粪便来源的解淀粉芽孢杆菌，能够发酵产生高活性的纤维素酶。项目拟在前期工作的基础上，解析该纤维素酶系组成和分子结构，阐明其催化作用的分子机理；研制高效分泌表达纤维素酶各组分的工程菌株及其发酵工艺，明确重组纤维素酶对于菜籽粕、棉籽粕等饲料原料中纤维素的体外协同降解模式。项目的研究成果不仅可以丰富现有纤维素酶的知识，更可以为其实际应用奠定基础。

我国每年需要消耗大量的饲粮，人畜争粮的矛盾日渐突出，开发非常规饲料资源已经是大势所趋。近年来，小麦麸、菜籽粕等高纤维素原料越来越多的用于猪、鸡等配合饲料中。由于纤维素含量高、难以降解，造成了有限饲料资源的浪费。目前的产纤维素酶菌株发酵活力低、水解效率有限，限制了其在饲料工业中的应用。研制高水解活性纤维素酶产品具有非常重要的意义。 本项目开展了一株来自藏猪粪便的解淀粉芽孢杆菌TL106的研究。通过培养基组分优化、培养条件摸索，确定了其最佳发酵工艺。最适豆粕粉添加量为2.3%，玉米粉添加量为10%，发酵温度为34℃，发酵时间为24 h。优化后解淀粉芽孢杆菌TL106发酵上清液中的蛋白酶和纤维素酶的活力提高到2397.73 U/mL和14.46 U/mL。.对TL106全基因组进行了序列分析。结果显示，其基因组全长3.98 Mb，并含有一个16, 916 bp的质粒。全基因组编码4130个开放阅读框（ORF），其中3016个ORF的功能得到了注释，1114个ORF功能未知；含有39个RNA编码基因。其基因组中有144个碳水化合物活性酶，占基因总数的3.48%。克隆了TL106纤维素酶基因，构建了重组表达菌株，诱导表达后，发酵液酶活仅有1.25 U/mL，不具有实际应用价值。.开展了TL106发酵上清液酶解菜籽粕的研究。菜籽粕经酶解后，粗蛋白含量提高了17.96 %，粗脂肪含量提高了60.48 %，小肽含量提高了145.17 %，总能提高了0.72 %；中性洗涤纤维NDF降解了8.26 %，酸性洗涤纤维ADF降解了18.76 %，粗纤维CF降解了0.74 %，硫甙降解了41.47 %，异硫氰酸酯ITC降解了37.03 %，恶唑烷硫酮OZT降解了42.55 %；酶解对菜籽粕营养价值提高和抗营养因子去除均有效。.开展了TL106发酵上清液酶解青稞的研究。青稞经酶解后，粗蛋白含量提高了24.0 %，粗脂肪含量提高了12.65 %，小肽含量提高了81.98 %；青稞经酶解后，淀粉降解了2.6 %，中性洗涤纤维NDF降解了33.68 %，酸性洗涤纤维ADF降解了46.72 %，粗纤维CF实际降解了23.66 %，β-葡聚糖降解了83.99 %；酶解对青稞营养价值提高和抗营养因子去除均有效。.项目通过TL106发酵工艺和预消化菜籽粕、青稞的研究，为其实际应用奠定了基础。