神经调节蛋白3（NRG3）基因突变在先天性巨结肠中致病机制的研究

Hirschsprung’s disease (HSCR) is the most common malformation of pediatric digestive tract that can cause functional bowel obstruction, it’s a complicated disorder of enteric nervous system, and always associated with multiple genes and factors. by far, all the mutations arising from the 11 known predisposing genes can only account for aetiological agents that Less than 5%. Our earlier case-control study of the whole exome sequencing of a Hirschsprung’s disease family and the sporadic sequencing has identified the neuregulin 3 (NRG3) as the predisposing gene of HSCR. Meanwhile, the zebrafish microinjection and mRNA interference experiment have already confirmed the fact that lack of NRG3 can interfere with the normal development of the enteric nervous system (ENS), as well as the maturity. Based on microinjectiontechnique, immunohistochemistry and in situ hybridization technique, our projects intend to proceed a research on the effect of the NRG3 mutation impacted on ENS. And further clarify the pathogenesis of NRG3 mutation in HSCR, eventually provide clinical and theoretical basis for the therapy of HSCR.

先天性巨结肠是导致功能性肠梗阻的最常见小儿消化道畸形，属多基因、多因素参与的肠神经系统发育异常的复杂疾病。目前，在已知的11个易感基因累积发现的突变仅能解释不足5%患者的发病原因。课题组前期通过对一个先天性巨结肠家系进行全外显子测序和病例-对照研究，确定了神经调节蛋白3（NRG3）基因为先天性巨结肠的易感基因。同时经斑马鱼显微注射和mRNA干扰预实验，初步证实该蛋白功能缺失可干扰斑马鱼肠神经系统（ENS）的正常发育及成熟。本项目拟在斑马鱼NRG3敲低模型及细胞共培养模型基础上，采用显微注射技术、原位杂交及免疫组织化学技术在分子蛋白水平、神经细胞水平、肠神经系统发育水平上研究NRG3突变对肠神经系统发育的影响，进一步阐明NRG3突变在先天性巨结肠中的发病机制，为先天性巨结肠治疗提供临床及理论依据。

课题组前期通过全外显子测序确定了先天性巨结肠易感基因神经调节蛋白3（NRG3）。预实验证实该蛋白功能缺失可干扰斑马鱼肠神经系统（ENS）的正常发育、成熟。本课题拟进一步从蛋白分子功能、体外调节神经细胞生长和轴突形成、斑马鱼肠神经系统发育三个水平研究NRG3突变对NRG3-ErbB4-PI3K/MAPK通路影响肠神经系统发育导致先天性巨结肠发病的机制。. 研究表明：病例-对照研究发现NRG3基因3个内含子SNP (rs10748845，rs10883866及rs6584400)与HSCR发病风险无相关性（P＞0.05）。内含子发病风险不高，提示NRG3的致病机制主要通过外显子突变导致巨结肠发生。在分子水平上，免疫共沉淀检测表明NRG3 (853 G>A)突变影响蛋白的折叠，使NRG3蛋白丧失活性，影响与ErbB4结合。NRG3 (853 G>A)突变后可导致NRG3-ErbB4-PI3K/MAPK通路中ERK、PI3K磷酸化受阻但不影响其表达，但引起RET表达量明显降低。高通量RNA-seq检测以及生信分析亦证实NRG3主要通过MAPK、PI3K-Akt、ErbB4三个信号通路调控RET基因，其中通路中Col4a2、Col4a1、Fn1、Fzd1、Ddit3、Akt1、Jak2、Ccnd1基因与巨结肠发生发展密切相关。在细胞水平上，NRG3突变导致SH-SY5Y细胞轴突延伸受到影响，进而影响神经系统发育。在动物水平上,NRG3功能缺失导致斑马鱼胚胎破膜率降低，死亡率增加，影响胚胎发育。斑马鱼肠神经细胞荧光染色显示NRG3功能缺失影响肠神经的延伸。原位杂交显示RET基因表达降低。. 从以上三个方面解释了NRG3是RET表达调控的重要因子，NRG3通过NRG3-ErbB4-PI3K/MAPK信号途径调节RET表达而导致先天性巨结肠发病，为进一步解释巨结肠致病机制奠定了基础。