RET基因新发突变和体细胞突变在先天性巨结肠的致病作用及机制研究

Hirschsprung disease (HSCR) is a congenital malformation of the enteric nervous system (ENS) standing as a model for genetic disorders with complex patterns of inheritance. The tyrosine kinase receptor RET is the major gene but clear heritability for most patients and familial cases are still missing. Our previous study detected a high frequency (8 out of 9, 89%) of de novo and somatic mutations in RET by the combination of targeted next-generation sequencing and amplicon-based deep sequencing on multiple DNA from the same person. With the aim of delineating the mechanism and consequences of these mutations, we here plan to explore the concrete frequency and type of the de novo and somatic mutations in RET in a larger Chinese HSCR cohort, analyze the contribution of hypomorphic allele (3 enhancer SNPs) to the disease susceptibility, assess expression level of the RET gene regulatory network-related genes and evaluate developmental maturity of the ENS in colons of the mutation carriers. In addition, we will also use in vitro cultured HEK293, Neuro-2a and SK-N-SH cells to test the effects of identified RET-coding variants on RET phosphorylation and activation via ERK. Finally, transgenic zebrafish model will be utilized to further demonstrate their role in inducing ENS defects.

先天性巨结肠（HSCR）属于肠神经系统（ENS）发育异常疾病，遗传因素占主导地位。RET原癌基因功能异常是疾病发生的必要条件，但多数患者的病因和风险累积模式不清。我们的前期研究通过多样本高通量测序发现HSCR家系RET基因突变中新发突变和体细胞突变高达89%，为了明确其致病作用及机制，本项目拟利用高通量测序、快速基因型分析、基因表达定量、免疫组化染色等方法明确这两类突变在中国HSCR患儿中的发生频率和突变类别，阐明RET亚效等位基因的修饰作用和修饰强度，观察突变携带者肠组织中重要基因表达水平的变化情况和ENS的发育成熟度，同时辅以体外细胞功能实验、转基因斑马鱼模型分析突变对蛋白质功能和RET信号转导通路活性的干扰机制及其剂量依赖效应并在模式生物水平对突变干扰ENS发育进行进一步验证，为更好地解释本病临床表现多样、家族内部遗传规律不明确等现象提供新的线索和理论依据。

先天性巨结肠（HSCR）是导致功能性肠梗阻的最常见的小儿消化道畸形。RET原癌基因是主要致病基因，但存在遗传异质性高、无热点突变、外显不全等问题，相关机制尚未完全阐明。本课题先后利用83例中国HSCR患者及117个核心家系的357个样本进行二代测序、基于扩增子的深度测序（ADS）、TA克隆测序及数字PCR（ddPCR），发现患者自身及其父母存在高频RET基因新发突变及嵌合体变异。突变等位基因频率在不同组织中的分布具有相似规律：毛囊中最高，尿液中最低，外周血和唾液样本相近。利用6例嵌合体变异阳性样本对3种常用方法的特异性和敏感度进行比较，结果提示ddPCR的精度最高，ADS方法对变异频率在1%以上的位点的检出具有满意的敏感度，而NGS法则要求覆盖度达到500×以上时才有较高可信度。利用体外细胞功能实验证实RET基因突变p.Arg77Cys和p.Arg67insLeu可通过干扰蛋白糖基化影响细胞内定位和蛋白质功能；截短突变p.Trp85X, p.Glu252X, p.Tyr263X, p.Arg770X, p.Gln860X, p.Val778Alafs*1编码产生无功能的截短蛋白；经典剪接位点突变c.2802-2A>G可影响正常mRNA剪接、产生提前终止的密码子而影响RET蛋白功能；突变蛋白与正常蛋白共存时，可通过抑制正常蛋白的表达和功能发挥显性负效应。反式RET增强子（rs2506030、rs7069590、rs2435357）的风险等位基因（G、T、T）频率在正常对照、HSCR家系内未受累个体及HSCR患者中呈逐渐升高、聚集效应（OR值分别为2.09, 2.71, 7.59），3个位点的杂合子型父母都存在风险等位基因/非风险等位基因的显著传递不平衡（P<0.001）。中国各地区人群中风险单体型（G-T-T）的实际携带率都显著高于预期（P<4.64×10-186），约60%人群携带单拷贝，10%携带双拷贝。这些常见变异可通过降低RET的转录活性增加携带者的患病风险，与编码区突变构成复合杂合遗传致病机制。上述研究结果为更好地解释“遗传率丢失”现象提供了新线索和理论依据。