ROS-NLRP3-Caspase1介导的肠神经嵴细胞焦亡在先天性巨结肠发生中的机制研究

Hirschsprung's disease (HSCR) is one of the most common congenital gastrointestinal malformations, but the mechanism remains to be explored. According to mRNA microarray results, the expression of Caspase-1 (key factor of pyropsis) was significantly higher in HSCR-affected tissue compared with counterpart. Further examination validated that Caspase-1 and its activation-related molecule NLRP3 were highly expressed in HSCR-affected tissue. In oxidative stress model of SH-SY5Y, ROS could promote cell pyroptosis，and enhance the expression of NLRP3 and Caspase-1. Based on these findings, we hypothesized that ROS triggered the activation of NLRP3-caspase-1 signal pathway in the development of HSCR, inducing pyropsis of the ENCCs. In the present study, we will conduct further investigations using a series of cellular and molecular techniques, such as gene transfection，flow cytometry，based on animal and cell line models, to exploe the role of pyropsis (ROS-induced stimulation of NLRP3-caspase-1) in ENCCs of HSCR. This project is expected to provide new perspectives for the mechanism of HSCR, and provide possibilities in prevention and treatment of HSCR during embryonic development.

先天性巨结肠（Hirschsprung's disease, HSCR）是最常见的先天性消化道畸形之一，但其具体发生机制尚不明确。我们应用mRNA 芯片筛选HSCR患者病变肠段组织与对照组织差异化表达基因时发现，细胞焦亡关键分子Caspase-1显著高表达。组织验证发现，Caspase-1及其激活相关的重要分子NLRP3在HSCR病变肠段均高表达。体外细胞模型提示, ROS可以促进神经细胞SH-SY5Y的焦亡，以及增强Caspase-1和NLRP3的表达。提出科学假设为：ROS通过激活NLRP3-Caspase-1信号通路，诱导肠神经嵴细胞（ENCCs）焦亡，参与HSCR的发生。我们拟采用基因转染、流式细胞等实验技术，利用细胞及动物模型，研究ROS-NLRP3-Caspase-1介导ENCCs焦亡，参与HSCR发生的机制。本课题有望为HSCR的发生机制提供新视点和胚胎期防治提供新新途径。

氧化应激和炎症小体已经被证实和神经元死亡有关。先天性巨结肠(Hirschsprung’s diseae, HSCR)是一种结肠梗阻性疾病，由肠道远端神经节细胞定植异常引起，与肠神经嵴细胞(ENCCs)的增殖和迁移有关。本研究中，我们提出假设，氧化应激和NLRP3炎症小体参与了HSCR的发生，并进行了下列的研究。qRT-PCR结果显示氧化应激组（D-半乳糖）新生大鼠和先天性巨结肠患儿病变段肠组织内NLRP3，ASC，Caspase-1表达量增加。 此外，我们发现肠神经节细胞标志物cathepsin D 在氧化应激组新生大鼠肠道中的表达较对照组是显著降低的。结果表明，H2O2处理组，SH-SY5Y细胞LDH释放量，PI，以及Caspase-1/Tunel双阳性细胞明显增加。然后，我们用ROS清除剂、Caspase-1抑制剂和NLRP3-siRNA对SH-SY5Y细胞进行预处理，以验证ROS/NLRP3/caspase-1轴在SH-SY5Y细胞死亡中的作用。上述处理均减弱了ROS诱导的Caspase-1裂解和Caspase-1介导的细胞焦亡，恢复了细胞活力，缓解了LDH释放，降低了PI和Caspase-1/Tunel双阳性细胞数。综上所述，氧化应激可通过NLRP3炎症小体激活caspase-1依赖的细胞焦亡途径，导致肠远端神经节细胞缺失，导致HSCR发生。