稻瘟菌一个含多KH结构域致病蛋白作用机理的研究

Rice blast is a widely distributed and devastating fungal disease on rice throughout the world and is a model system that is widely used for studying fungus-plant interactions. Deciphering the pathogenesis of the rice blast fungus will contribute to designing novel strategys for controlling the rice blast and many other fungal diseases. Though many studies have been carried out to investigate the molecular mechanism on pathogenesis in M. oryzae from diverse aspects, studies are lacked on the roles of post-transcriptional gene control in pathogenesis. Previously, we isolated an insertion mutant of M. oryzae that was defected in pathogenicity, in which a gene named PCG6 was disrupted. With the gene knockout and complementation, we confirmed that PCG6 is important for pathogenesis and found that PCG6 negatively regulates the expression level of the glutamate synthase gene GLT1. According to the primary structure, Pcg6 is a multiple-KH-domain-containing protein and may be invovled in regulating mRNA stability. In this study, we plan to integrate the approches of molecular genetics, molecular biology and bioinformatics, to decipher which genes are targets regulated by PCG6 and how PCG6 regulates glutamic acid metabolism. Our study will provide novel evidences for elucidating how the post-transcriptional gene control is involved in the pathogenesis of plant fungal pathogens.

稻瘟病是在世界各水稻产区广泛发生、危害极大的真菌性病害，也是许多植物病理工作者研究的模式系统。深入地解析稻瘟菌的致病机理有助于发现控制稻瘟病及其它真菌病害的新途径。尽管已有许多研究从不同的角度来解析稻瘟菌的致病机理，但是关于基因转录后的调控过程在稻瘟菌致病中所起作用的研究还很缺乏。在前期工作中，本课题组从稻瘟菌中分离鉴定了一个致病突变体，在该突变体中一个编码含多个KH结构域蛋白的基因PCG6被破坏。本课题组已通过基因敲除和基因互补确认PCG6在稻瘟菌致病中发挥重要的作用，并发现PCG6负调控谷氨酸合成酶基因的表达。PCG6编码的蛋白推测通过调控靶标基因mRNA的稳定性起作用。本课题研究拟通过分子遗传学等方法，揭示PCG6在稻瘟菌中是通过调控哪些靶标基因mRNA的稳定性来参与致病性以及PCG6调控谷氨酸代谢的机理。本研究将为揭示植物病原真菌致病性与基因转录后调控之间的关系提供新的证据。

由稻瘟菌引起的稻瘟病是世界水稻种植区内的毁灭性真菌病害。目前稻瘟菌致病分子机制的研究较为深入，但关于基因转录后调控在其致病与发育中作用的研究报道还很缺乏。在本项目中，我们克隆并功能分析了一个编码含多KH结构域的新基因PCG6，其编码蛋白通过参与基因转录后调控来控制稻瘟菌的致病与发育。与野生菌相比，pcg6敲除体的营养菌丝生长减慢、产孢量明显下降，且丧失了对寄主植物的致病性。侵染过程观察发现pcg6敲除体附着胞的形成严重缺陷，导致无法在寄主植物细胞内形成侵染菌丝；外源添加cAMP能够基本恢复pcg6敲除体附着胞的形成。亚细胞定位观察发现Pcg6-GFP定位于细胞质，在营养菌丝、分生孢子、附着胞和侵染菌丝中均有表达；Pcg6-GFP与参与RNA降解的P-body复合体的标记蛋白Dcp2-RFP共定位。重要的是，Pcg6与RNA降解途径的相关蛋白MoCaf1和MoNmd3免疫共沉淀，Pcg6-GFP与MoCaf1-RFP和MoNmd3-RFP有部分共定位，MoCaf1和MoNmd3与Pcg6418-488直接互作。这些结果表明Pcg6是细胞质RNA降解途径P-body复合体的组分。有意思的是，在pcg6敲除体中MoCaf1与MoNmd3的蛋白量均出现了上调；在野生菌中超表达这两个蛋白的转化子的产孢量均明显下降。比较转录组分析发现，PCG6的缺失导致2500多个基因的表达水平出现明显变化。对受Pcg6正调控的一个编码Sit4磷酸化相关蛋白的新基因MoSIPP1进行了功能分析，发现该基因的敲除体在发育和植物侵染中出现明显的缺陷；在野生菌中超表达受Pcg6负调控的基因MoRGS1导致菌株产孢能力明显下降。此外，在pcg6敲除体中编码谷氨酸代谢途径中的多种酶类，如谷氨酸合成酶MoGlt1的基因表达水平均明显上调。功能分析发现，Moglt1敲除体的产孢量明显下降，附着胞的形成及其介导的侵染、侵染菌丝的扩展均出现明显的缺陷。外源添加谷氨酸、谷氨酰胺等能使Moglt1敲除体的侵染能力显著地恢复。有意思的是，MoGLT1的缺失影响了细胞自噬标记蛋白MoAtg8的定位与降解，且影响了细胞内糖原和脂质体的代谢。综上所述，含多KH结构域蛋白Pcg6作为RNA降解途径P-body复合体的组分调控细胞质内mRNA的表达水平，进而控制稻瘟菌的致病与发育。