ClC-3氯通道介导甲状旁腺激素对成骨细胞的作用及机制研究

Osteoporosis is one of the most important health problems in the aging society. Parathyroid hormone(PTH) is one of the important hormones which regulates calcium homeostasis．PTH has dual effects on bone metabolism.Intermittent administration of PTH induces bone formation，but the mechanism is unclear．Because of the complicated and unclear mechanism of PTH in bone metabolism, the application of PTH in osteoporosis and other related diseases is limited. ClC-3 chloride channel has been speculated to contribute to the acidification of synaptic vesicles and endosomes. Clcn3-/- mice are smaller than their littermates soon after birth, and exhibited skeletal abnormality, such as kyphoscoliosis, developmental retardation, abnormal metabolism of calcium and phosphorus and higher mortality.In previous study, we first analyzed ClC-3 expression in MC3T3-E1 cells and primary mouse osteoblasts and demonstrated the function of ClC-3 in osteodifferentiation. We also found that PTH promoted the expression of ClC-3 in osteoblasts.Therefore,we hypothesize that PTH promote osteogenic differentiation through ClC-3. In the study, we will focalize on ClC-3 to research the mechanism of promotion of PTH in osteogenesis using gene transfection, RNA iterference, real-time PCR, western blot and immumofluorescence method. Animal experiments will verify the mechanism of PTH and ClC-3 in osteoblasts. The study will be helpful to inspire a novel thinking for researching the mechanism of PTH in bone formation. Meanwhile, the research will also further investigate the novel function of ClC-3 in bone metabolism which should be the research foundation of using chloride channels as therapeutic targets for treatment of osteogenesis-related diseases.

骨质疏松是老龄化社会面临的重要健康问题。甲状旁腺激素（PTH）作为体内调节骨代谢的重要激素，因作用机制复杂且尚不明确，严重影响其在骨质疏松及其它骨病中的临床应用。ClC-3为电压门控型氯通道之一，近年研究表明其作用不仅局限于细胞容积调控和酸化调节，还与细胞增殖、凋亡、破骨细胞的功能相关。有研究发现，Clcn3基因敲除小鼠表现出骨代谢异常，我们前期研究也发现ClC-3在多种成骨谱系细胞中均有表达并能促进成骨细胞的分化，进一步发现PTH刺激下ClC-3发生显著变化，是否ClC-3介导了PTH在成骨细胞中的作用还不清楚。因此，本项目在前期工作基础上，拟通过基因转染、siRNA、免疫荧光、Micro CT等技术体外及体内探讨ClC-3在成骨细胞中介导PTH刺激及下游信号的作用机制，为PTH在骨代谢中的作用机制研究开辟新的思路，同时为使用离子通道药物设计骨代谢疾病新的治疗靶点提供理论依据。

骨质疏松是老龄化社会面临的重要健康问题。甲状旁腺激素（PTH）作为体内调节骨代谢的重要激素，因作用机制复杂且尚不明确，严重影响其在骨质疏松及其它骨病中的临床应用。ClC-3为电压门控型氯通道之一，近年研究表明其作用不仅局限于细胞容积调控和酸化调节，还与细胞增殖、凋亡、破骨细胞的功能相关。本论文重点研究了PTH刺激对MC3T3-E1细胞中ClC-3氯通道表达的影响及ClC-3氯通道在PTH促成骨过程中的作用，首先，我们对成骨样细胞MC3T3-E1给予不同浓度、不同给药方式的PTH刺激，通过检测成骨相关基因（如Alp、Runx2）表达情况的改变，筛选出PTH促进成骨分化时最适宜的药物浓度及刺激方式。结果显示，10-9 M浓度PTH间断刺激可以明显促进MC3T3-E1细胞成骨相关基因Alp与Runx2的表达，并可促进ClC-3氯通道基因及蛋白的表达上调。这些结果提示我们MC3T3-E1细胞中ClC-3氯通道能够响应PTH的刺激并发生变化。我们利用基因转染的方法下调MC3T3-E1细胞中ClC-3氯通道基因的表达水平，观察成骨细胞中ClC-3氯通道在正常表达及低表达两种情况下，在PTH间断刺激时，成骨相关基因（Alp、Bsp、Oc、Osx、Runx2）的表达情况及MC3T3-E1细胞的体外矿化能力。研究结果表明，PTH间断刺激时，ClC-3氯通道抑制组的成骨相关基因的表达水平明显低于ClC-3氯通道正常表达组与空白对照组，同样，在ClC-3氯通道抑制组细胞的体外矿化能力也相应降低。分别用特异性siRNA调节成骨细胞MC3T3-E1中转录生长因子TGF-β1及ClC-3氯通道基因的表达水平，发现在PTH间断刺激下，成骨细胞中仅干扰TGF-β1基因表达后，ClC-3氯通道基因及蛋白表达水平增强；仅干扰ClC-3氯通道基因后，TGF-β1基因及蛋白表达水平升高。同样在PTH间断刺激下，在分别干扰ClC-3氯通道基因和TGF-β1基因后，成骨相关基因(Alp、Bsp、Oc及Runx2)表达水平较对照组明显降低（P<0.05）。然而共同干扰两者之后成骨相关基因表达较对照组无明显差异（P>0.05）。本课题初步研究了ClC-3在PTH促成骨过程中的作用机制，为PTH在骨代谢中的作用机制研究开辟了新的思路，同时为使用离子通道药物设计骨代谢疾病新的治疗靶点提供理论依据。