TRPV1通过Fos蛋白调控小鼠原代心肌细胞内NGF表达的机制研究

Cardiac sympathetic nerve remodeling is an important factor of malignant arrhythmia, and the level of NGF in myocardium is a direct factor leading to local nerve regeneration. At present, the understanding of the regulatory mechanism of NGF in cardiac myocytes is still unclear. In the previous studies, the activation of cardiac TRPV1 receptor could upregulate the expression of NGF in cardiomyocytes, which may be regulated by c-fos gene. This study is to carry out further research on the intracellular mechanism of this regulatory relationship. The primary cardiomyocytes of mice were used to compare the expression of NGF mRNA and protein level in cardiac myocytes under different intervention methods (regulating each link of regulatory signaling pathway) in wild type mice and TRPV1 knockout mice. Meanwhile, Western Blotting, RT-PCR, ELISA and CHIP were used to monitor the regulation of protein activation and related gene transcription and protein levels, as well as transcriptional activity. Subsequently, a co-culture model of cardiac myocytes and mouse sympathetic neurons was used to compare the effects of NGF expression on sympathetic nerve proliferation in wild type mice and TRPV1 knockout mice under different intervention.

心脏交感神经重构是导致恶性心律失常的重要因素，而心肌组织中NGF水平的升高是导致心肌组织局部神经再生的直接因素。目前对心肌细胞内NGF表达的调控机制认识仍不明确。申请人在前期研究中发现心脏TRPV1受体的激活能够上调缺氧小鼠心肌细胞中NGF的表达，其机制可能是通过调控c-fos基因而实现。本课题拟就这一调控关系的细胞内机制开展进一步研究。计划采用小鼠原代心肌细胞，比较野生型小鼠和TRPV1敲除小鼠在不同干预方法下（对信号通路各环节进行调控）心肌细胞内NGF mRNA 表达情况和蛋白水平。同时采用Western Blotting、RT-PCR、ELISA、CHIP等方法监测下游信号通路各环节蛋白激活情况，以及相关蛋白在转录水平和蛋白水平的变化。随后采用心肌细胞与小鼠交感神经细胞共培养模型，比较不同干预条件下野生型小鼠和TRPV1敲除小鼠组NGF表达差异对交感神经增生的影响。

本研究主要对“TRPV1对缺氧诱导心肌细胞内NGF表达和细胞凋亡的影响及其机制”进行深入研究，拟探讨TRPV1受体对缺氧心肌细胞内NGF表达的调控作用，以及受TRPV1调控后缺氧心肌细胞的凋亡情况及可能机制。研究内容包括以下方面：.1）缺氧HL-1细胞内TRPV1蛋白的表达水平变化；.2）采用TRPV1受体抑制剂以及其下游相关通道蛋白抑制剂，验证TRPV1下游效应通路.3）观察不同干预手段下细胞内NGF表达水平，验证TRPV1对NGF的调控机制.4）观察TRPV1及其下游通路的干预手段对凋亡相关重要蛋白的影响，验证TRPV1-NGF与缺氧心肌细胞凋亡之间可能的调控关系。..研究的重要结果如下：.1）缺氧显著增加了HL-1心肌细胞TRPV1的表达；.2）采用不同干预手段，（如抑制剂，siRNA）调控TRPV1通道、CaMKII途径、CREB途径和AP-1蛋白水平，我们发现抑制TRPV1和CaMKII途径可降低缺氧诱导的CaMKII磷酸化和CREB活化。而CREB通路活性降低会进一步降低缺氧HL-1心肌细胞Fos蛋白和c-fos蛋白的mRNA表达，但对c-jun蛋白的 mRNA水平无影响。而采用siRNA靶向沉默c-Fos和c-Jun下调AP-1和NGF的表达。.3）我们用抗NGF中和抗体（nAb）观察抗NGF-nAbs对缺氧HL-1心肌细胞氧化应激的影响，结果表明，抗NGF-nAbs可进一步提高心肌细胞MDA水平、NADPH氧化酶活性和Bax表达，降低GSH水平和Bcl2表达。.4）我们进一步观察了用TRPV1通道拮抗剂、CaMKII途径抑制剂、CREB途径抑制剂、c-Fos和c-Jun siRNA以及抗NGF-nAb等手段干预细胞后心肌细胞的调往情况，结果证明这些调控手段增加了缺氧诱导的HL-1心肌细胞凋亡，而SOD处理则逆转了这些影响。..研究结果提示，提示TRPV1在体外可调节CaMKII/CREB/NGF轴，降低氧化应激，保护缺氧诱导的HL-1心肌细胞。其研究意义在于提示对于心肌细胞缺氧损伤凋亡，激活TRPV1受体可能能够通过降低细胞氧化应激反应发挥抗心肌细胞凋亡作用