家蚕微孢子虫Septin蛋白的鉴定及其在裂殖增殖中的作用研究

Rapid proliferation of Nosema bombycis meront is the key development period of causing pebrine. Blocking or interfering the schizogamy of N. bombycis is an important strategy to control the disease. Septin was a significant protein family involved in cell division and pathopoiesis by forming cytoskeleton and recruiting proteins. Three Septin gene were annotated in N. bombycis genome and NbSeptin 1 can be located to the mother-bud neck. This project is aimed to characterize NbSeptin by analysising protein polymerization and structure features, observing dynamic expression in developing meront and identifying interacting proteins. In addition, the function of NbSeptin in schizogamy would be illuminated by RNAi, ScFv blocking in vivo, Mutant recovery experiments in yeast. According to this project, we can explore the schizogamy process of Nosema bombycis and provide targets for pebrine control and prevention.

家蚕微孢子虫裂殖增殖期是病原体感染宿主家蚕后快速增殖致病的关键发育时期。限制或阻断微孢子虫裂殖增殖是防治微粒子病的重要策略。Septin是一类通过形成骨架结构和招募蛋白等方式参与胞质分裂及病原菌致病等重要过程的蛋白家族。研究发现，家蚕微孢子虫具有3个Septin蛋白，且NbSeptin 1能够导向酵母出芽的芽颈处。本项目旨在鉴定家蚕微孢子虫NbSeptin蛋白的聚合形式及结构特征，研究NbSeptin在裂殖增殖期的动态表达变化并鉴定其互作蛋白，采用RNAi、抗体封闭、酵母突变株功能回复等方法对NbSeptin在裂殖增殖中的作用进行探讨。通过本项目的实施，阐释家蚕微孢子虫裂殖增殖过程，并为家蚕微粒子病的防治和抗性素材创建提供分子靶标。

微孢子虫（Microsporidia）是一类专性细胞内寄生的单细胞真核生物，能够感染从无脊椎动物到脊椎动物在内的几乎所有动物，包括重要的经济昆虫蜜蜂、家蚕甚至免疫缺陷的病人。微孢子虫的生活史与宿主紧密联系，一般分为三个阶段：感染期、裂殖增殖期和孢子形成期，其中裂殖增殖期既是细胞内发育的起始时期，也是微孢子虫在宿主细胞中快速增殖、传播的关键阶段。因此截断或限制家蚕微孢子虫的裂殖增殖是微孢子虫防控的重要策略。Septin是一类高度保守的GTP结合蛋白，广泛存在于酵母、线虫和哺乳动物等除植物以外的真核生物中。其他真菌的研究表明，Septin可以通过形成细胞骨架结构和招募蛋白等参与细胞分裂这一重要生物学过程。因此，我们以Septin的功能研究为切入点开展了微孢子虫裂殖增殖的相关研究，以期更加深入的了解微孢子虫的侵染及增殖机制。本研究通过生物信息学方法筛选获得家蚕微孢子虫的3个Septin基因，通过序列分析、保守性分析、转录特征分析、亚细胞定位特征分析和互作分析等对家蚕微孢子虫的Septins进行鉴定，并分析其在裂殖增殖期的作用。主要研究结果摘要如下：（1）鉴定了家蚕微孢子虫的3个Septin蛋白NbSeptin1（NbSPT1）、NbSeptin2（NbSPT2）和NbSeptin3（NbSPT3）。氨基酸序列分析和同源蛋白聚类分析表明NbSPT1、NbSPT2和NbSPT3可能具有功能差异。转录特征分析表明NbSeptins 在微孢子虫中持续转录，且均在裂殖增殖期出现高量转录；（2）建立了微孢子虫增殖时期荧光标记法，并以此技术分析发现NbSeptins主要定位于裂殖体膜，且NbSPT2和NbSPT3在家蚕微孢子虫的一对耦核之间存在线状共定位。NbSeptins蛋白之间形成聚合物可能在裂殖体耦核的分离、隔离及物质交流中发挥作用；（3）NbSPT2与家蚕微孢子虫类枯草杆菌蛋白酶NbSLP1和NbSLP2存在相互作用，可能起到稳定酶的作用。NbSPT2与NbSLP1的prodomain结合可抑制蛋白酶的自剪切，稳定酶的前体结构。（4）NbSPT2与特殊侵染装置极管的主要蛋白NbPTP1在弹出的极管与孢壁连接处相互作用，可稳定极管与孢壁的连接，保证孢原质的正确输送。通过本课题的开展，解析了NbSeptins在家蚕微孢子虫感染与增殖中的作用，该蛋白可作为微孢子虫检测及药筛的靶标。