HBsAg启动子区转录因子Sp1结合位点新发突变对乙肝病毒生物学功能的影响及机制研究

Envelope protein played an important part in hepatitis B virus (HBV) life cycle. Mutations in the functional region of HBV envelope gene produeced a great impact on transcriptional activity of envelope protein and viral pathogenicity. Our previous studies have showed new mutations occurred within the functional binding site of the Sp1 transcription factor located in the major surface antigen promoter under the pressure of Peginterferon therapy. The mutations not only decreased the predictive value of HBsAg in Peginterferon therapy by reducing the level of transcription from the major surface antigen promoter, but also induced an imbalance in the synthesis of the surface proteins and their consequent retention within the endoplasmic reticulum of the hepatocytes. So the new mutant was proposed to be associated with the bioactivities of HBV. To explore the potential mechanism of transcription regulation of the mutant, DNA-binding ability, protein complex change and posttranslational modifications of Sp1 are investigated by epigenetics and molecular biological ways. Further study of the impacts of envelope protein retention on viral replication, secretion, infection and cccDNA pool would be conducted by biological phenotypic assay in vitro. Our study is of great significance on illustration of the impact of transcription regulation of the mutant on bioactivities of HBV, and provides a new insight into the therapeutic target site.

包膜蛋白在乙肝病毒（HBV）生命周期中具有重要意义，编码基因主要功能区位点突变对其转录表达及HBV生物致病性产生重要影响。本项目组前期工作发现在干扰素抗病毒药物的选择压力下位于HBsAg启动子区转录因子Sp1的结合位点产生新发突变，通过抑制包膜蛋白转录进而干扰抗病毒疗效的判断，并进一步影响包膜蛋白的分泌，因此推测该新型突变对HBV生物学功能具有一定作用。本申请项目拟通过表观遗传学分析及分子生物学手段，在转录蛋白结合能力、蛋白相互作用及蛋白修饰水平上，探讨Sp1结合位点新发突变调控包膜蛋白转录的相关机制，并进一步通过已建立的体外HBV表型研究平台，分析转录活性改变后滞留在内质网中的包膜蛋白对病毒的复制、分泌、感染能力及cccDNA扩增等生物学行为的影响。本研究将有助于阐明HBsAg启动子区转录因子Sp1结合位点新发突变对HBV生物学功能的调控机制，为HBV抗病毒治疗的新靶点提供理论依据。

研究背景及研究目的：目前乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）滴度显著 下降作为乙型肝炎病毒e抗原（HBeAg）阳性患者采用聚乙二醇干扰素抗病毒治疗停药的判断指标。由于乙型肝炎病毒（HBV）自身的高度变异性，HBsAg变异可影响干扰素治疗过程中对表明抗原的判读导致停药后的病毒学复发。本研究分析慢性乙型肝炎患者采用聚乙二醇干扰素抗病毒治疗过程中血清HBV分离株包膜蛋白前S/S区（PreS/S）准种的变异情况，并进一步分析突变株对病毒生物学表型产生的影响以探讨引起停药复发的病毒学分子机制。.研究方法：本研究共收集81例聚乙二醇干扰素治疗12个月e抗原阳性的慢性乙型肝炎患者，其中4例患者作为进一步研究群体，他们不仅出现e抗原血清学转换，并且治疗3个月是S抗原≤1500 IU/ml 或6个月HBsAg ≤300 IU/ml且下降大于1 log，同时以达到持续病毒学应答的42例患者作为对照。收集治疗基线、治疗12周及停药复发（如果存在）血清标本，抽提乙肝病毒病毒DNA，分析停药复发患者在治疗过程中及复发时PreS/S区准种的动态变化，体外真核表达观察PreS/S区突变对HBsAg表达的影响，进一步通过细胞荧光素酶实验观察PreS区突变对S区启动子的影响，并利用反式互补技术观察PreS/S区突变对病毒复制及分泌的影响，采用实时荧光Taqman双探针技术检测细胞共价闭合环状DNA（cccDNA）病毒池的变化，及变异位点对病毒感染力的影响。.结果： 4例停药复发的患者中有2例存在表明抗原前S区T3046G/C3048T变异位点，此变异株在抗病毒治疗过程中及停药复发后逐渐成为优势株。体外实验证实P127T突变可造成HBsAg的检测滴度下降；进一步分析表明这种发生在S启动子区的突变可通过下调S启动子的转录活性导致主蛋白（SHBs）表达量的降低，从而改变大蛋白（LHBs）/SHBs的比例，影响包膜蛋白的表达及病毒的分泌，促进细胞内cccDNA合成，并且病毒感染力较野毒株增强。.结论：在慢性乙型肝炎患者聚乙二醇干扰素抗病毒治疗过程中，PreS/S启动子去突变可通过改变包膜蛋白的表达和病毒分泌，进而促进胞内cccDNA合成以及通过增强病毒的感染能力，为病毒长期持续存在提供生存优势。