孕期MVAD通过TLRs影响仔鼠肠道屏障功能的机制研究及干预效果探讨

由腹泻而导致新生儿死亡率高达17%,仅次于肺炎,而维生素A缺乏（VAD）是目前世界性三大微量营养素缺乏性疾病之一，在发展中国家孕妇和5岁以下儿童尤为严重。研究表明VAD可导致肠道屏障功能下降，引起腹泻，但具体调节机制尚不清楚。TLRs是连接天然免疫和获得性免疫关键蛋白，与肠道屏障功能密切相关，本课题组前期研究发现孕期MVAD仔鼠肠道TLR2、TLR4表达水平显著降低。因此本项目拟采用孕期MVAD大鼠模型及体外共培养方法，以TLRs为切入点，通过LPS感染，从RA信号通路、屏障功能相关连接蛋白、肠道粘膜免疫相关淋巴细胞等三个不同角度，探讨VA调节TLRs信号通路的分子机制，明确孕期MVAD对生后早期仔鼠肠道上皮屏障功能及粘膜免疫调节的影响；同时观察不同时间点VA补充干预效果，为孕期MVAD导致仔鼠肠道屏障功能降低寻找最佳补充"时间窗"，对VA辅助治疗肠道感染、预防腹泻提供实验依据和理论基础。

本项目在成功建立孕期VA缺乏大鼠模型的基础上，取得以下研究结果：1. 利用孕期VA缺乏（VAD）与孕期VAD生后VA正常（VAD-N）两种动物模型，通过LPS感染前后的比较，发现生命早期VAD可明显降低血清中视黄醇浓度和CD8+ IEL的数量；肠道内IgA的分泌水平、脾细胞中的CD4+CD8+ T淋巴细胞比例受LPS感染和体内VA水平双重作用的影响；而孕期VAD显著增加肠系膜淋巴结B细胞的数量，明显降低PP结中CD11c+树突细胞和CD4+CD25+ T细胞比例，提示生命早期VA缺乏有可能降低肠道粘膜免疫功能。2. 通过四个时间点的VA补充实验比较，发现LPS感染均可诱导孕后期(VASP)、生后1d (VAS1)和14d (VAS2)补充组IgA水平增高；在VASP和VAS1两组中可见肠系膜淋巴结B细胞数量的明显降低，以及CD8+ IEL比例的显著增加；而对于脾的CD4+CD25+ T细胞和PP结中CD11c+树突细胞数量在VAS1组有明显的变化；提示只有在生后早期进行VA补充才能恢复孕期VAD所造成的影响。3. 相关机制研究发现，孕期VAD的仔鼠肠道呈现轻度炎症症状，肠道中RAR和TLR4表达水平降低；体外研究表明，视黄酸（RA）预处理可增加Caco-2细胞的跨上皮电阻，RAR、TLR4、ZO-2表达水平升高；当Caco-2细胞过表达或抑制RAR时，TLR4及ZO-2的表达相应增高或降低，进一步的IP检测结果表明，RAR与TLR4、TLR4与ZO-2之间均有相互作用，提示RA可通过RAR信号通路，上调TLR4，增强肠上皮屏障功能。