家蚕微孢子虫极管蛋白的特征鉴定及功能分析

Nosema bombycis is a pathogen of pebrine of silkworm. It can cause destructive pebrine disease and lead serious losses for their vertical transmission. Polar tube, a special infectious organ, plays a key role in proliferation and infection. Currently, we identified the three gene sequences of polar tube proteins (PTPs) by comparing the genomic data of microsporidia including Nosema bombycis. However, the amino acid sequences of polar tube proteins in N. bombycis have no identity with others in microsporidia. Then, the ptp1 and ptp2 were colned and expressed in Escherichia coli. The results of indirect fluorescent assay suggested that PTP1 and PTP2 could located on the polar tube of microsporidia. Moreover, it was demonstrated that the PTP1, a polar tube protein, was glycosylated. In this study, the components and the precise location of the polar tube proteins would be identified. Glycosylation studying would be demonstrated the relationship of the polar tube glycoprotein and infection. This study would provide a new target for examining and controlling pebrine disease in sericulture and may shed new light for research on the host-parasite interaction.

家蚕微孢子虫专性寄生于经济昆虫家蚕，其快速的水平传播和经卵垂直传播所引发的家蚕微粒子病给我国乃至世界养蚕业造成巨大危害。极管作为微孢子虫特殊的侵染器官，在孢子增殖及感染宿主过程中发挥着至关重要的作用。本研究小组通过家蚕微孢子虫和其他微孢子虫基因组序列比对，发现了3个编码家蚕微孢子虫极管蛋白的相关基因序列，但它们与已报道的极管蛋白之间无序列同源性。前期研究分析了2个家蚕微孢子虫极管蛋白的定位特征，并鉴定了1个极管糖蛋白PTP1。本项目拟在前期研究基础上，利用本实验室拥有的家蚕微孢子虫和家蚕功能基因组研究平台，通过蛋白质组学的方法鉴定家蚕微孢子虫极管蛋白的组成特征，分析极管蛋白的表达定位特征，获取蛋白糖基化修饰信息，寻找与极管蛋白互作的孢子自身及宿主家蚕靶蛋白。本项目致力于探索极管蛋白在孢子增殖与侵染中的生物学功能，为阐明家蚕微孢子虫的侵染机制以及家蚕微粒子病的防治奠定坚实的基础。

微孢子虫是一类专性细胞内寄生的真核生物，其宿主广泛，可感染包括人类在内的几乎所有无脊椎动物和脊椎动物，对人类健康及养殖业造成巨大威胁。目前发现所有微孢子虫都能采用极管弹出的方式侵染宿主。作为微孢子虫特殊侵染器官——极管上的蛋白，研究极管蛋白的特征与功能对揭示微孢子虫的侵染机制具有重要意义。家蚕微孢子虫极管蛋白NbPTP1具有O-糖基化修饰，并且NbPTP1能与宿主家蚕BmE细胞发生结合，此结合能力与蛋白糖基化修饰特征无关，推测微孢子虫极管弹出后，会与宿主细胞间发生粘附。此外，发现NbPTP1与家蚕微孢子虫孢壁蛋白NbSWP9间存在互作，且NbSWP9主要定位于弹出极管的前端；而另一个孢壁蛋白NbSWP7并不与NbPTP1存在相互作用，却可以通过NbSWP9这个桥梁定位于成熟孢子的极管以及发芽弹出的极管上。表明孢壁蛋白通过与极管蛋白之间的互作来锚定极管，使其规则地盘绕于孢子内。除了自身互作蛋白外，我们还鉴定到NbPTP1的一个互作宿主靶蛋白家蚕Myosin-1b类蛋白，沉默Bmmyosin-1b后，家蚕微孢子虫在宿主家蚕内的增殖率明显降低。推测微孢子虫弹出极管刺破宿主细胞后，其极管蛋白1通过与宿主Myosin-1b蛋白的相互作用，使极管能稳定的刺入到宿主细胞中，从而保证孢原质向宿主细胞内的运输。另一方面，我们对微孢子虫的两种新的极管蛋白PTP4和PTP5进行了鉴定。不同于NbPTP1的定位特征，家蚕微孢子虫的NbPTP4和NbPTP5仅定位于发芽极管的前端和发芽孔位置，暗示其功能与NbPTP1存在差异。此外，我们与美国合作研究发现，感染人的海伦微孢子虫极管蛋白4（EhPTP4）定位于发芽极管的最前端，首次发现了与微孢子虫侵染相关的细胞受体蛋白 TfR1，分析证实了EhPTP4和TfR-1之间具有互作关系，缺失TfR-1后显著降低微孢子虫的侵染率，证明了海伦微孢子虫极管顶端是通过细胞内吞的作用进入宿主细胞以实现微孢子虫的入侵感染。我们的工作发现微孢子虫的极管蛋白除了组装极管的功能外，还可以与宿主发生相互作用以促进微孢子虫的侵染，为揭示微孢子虫侵染机制提供了新的线索和思路。本项目的部分研究成果已被Plos Pathogens、Infection and Immunity等国内外知名杂志发表，相信后续还有更重要的成果发表，希望本项研究能继续得到国家自然科学基金的支持。