西兰花脂肪族芥子油苷代谢途径的鉴定

Glucosinolates are important secondary metabolites specifically found in Brassicaceae and are involved in pest and pathogen stress responses. The degraded products of some aliphatic glucosinolates have anticancer property, for example, glucoraphanin, its degraded product is found to have strong anticancer activity and is considered as the strongest nature cancer preventing substance so far. The content of glucoraphanin in broccoli is much higher than in other plants, thus it has become one of the most important resources of anticancer medicine. However, in spite of its importance, the biosynthesis and degradation pathway of glucosinoaltes in broccoli has not been well reported. In this program, the transcriptome of broccoli will be sequenced and the candidate genes of aliphatic glucosinolates metabolism (including biosynthesis and degradation) will be predicted based on the known pathway in the model plant Arabidopsis. According to the structure of glucoraphanin, key candidate metabolism genes will be selected and analyzed. First, the coding sequence will be obtained through RACE method. Then, the recombined protein in E.coli will be used to analyze the enzyme activity in vitro. Transgenic broccolis with candidate gene overexpressed and knocked out will be established respectively to analyze the gene function in vivo. Based on the results, a primary metabolism pathway of aliphatic glucosinolates in broccoli will be established. This will provide strong theory support and gene resource for the cultivation of transgenic broccoli with high content of glucoraphanin and anticancer activity.

芥子油苷是十字花科植物中特有的重要次生代谢产物，参与植物抗病、抗虫等生物胁迫反应。某些脂肪族芥子油苷的降解产物对人类具有抗癌活性，如4-甲基亚磺酰丁基芥子油苷（也称萝卜硫苷）的降解产物具有极强的抗癌活性，被认为是植物来源最强的抗癌物质。西兰花中萝卜硫苷含量远高于其他植物，目前已经成为开发抗癌药物的重要资源，但其芥子油苷合成和分解代谢途径尚缺乏报道。本项目拟通过对西兰花进行转录组测序，以模式植物拟南芥中脂肪族芥子油苷代谢途径（包括合成和分解）为依据，初步筛选西兰花脂肪族芥子油苷代谢途径的候选基因，根据萝卜硫苷的结构特点选取其代谢关键基因，以RACE方法获得基因编码序列，通过细菌中重组蛋白进行体外活性鉴定，同时在西兰花中建立过表达和敲除基因的转基因株系进行体内的基因功能鉴定，初步建立西兰花脂肪族芥子油苷代谢途径。为基因工程方法培育具有高抗癌活性的西兰花提供理论依据和具有自主知识产权的基因资源。

芥子油苷是十字花科植物中的一种重要的次生代谢产物，与植物的生长发育、病虫害防御等密切相关，其中萝卜硫苷的水解产物萝卜硫素被证实具有卓越的抗癌功效，且安全无毒副作用。西兰花属于世界性蔬菜，含丰富的芥子油苷且萝卜硫苷含量远远高于其他植物，目前已经成为开发抗癌药物的重要资源。开展西兰花芥子油苷代谢途径及调控机制的系统研究，筛选代谢调控关键基因，从理论上全面完善十字花科植物芥子油苷代谢调控网络具有重要意义。本项目以前期工作中获得的西兰花转录组测序分析数据为基础，参照模式植物拟南芥中已经鉴定的芥子油苷代谢途径种的同源基因，利用RACE PCR的方法从西兰花中克隆并获得了若干个关键酶基因，其中包括BoCYP83A1, BoCYP83B1, BoSUR1, BoTSB1, BoTSB2, BoMYB51和BoTGG1，对这些基因在芥子油苷合成过程中催化、调控或降解作用等进行了分析，同时对这些基因的表达特点，及对不同外界环境和不同激素的响应进行了深入分析，为西兰花分子育种奠定了理论基础并提供了基因资源。研究结果表明，芥子油苷代谢过程中某些相关合成酶或降解酶，不仅影响芥子油苷的组分和含量，同时也与生长发育过程密切相关。其中BoTSB1,BoTSB2 除了促进芥子油苷的合成，同时也增强了生长素的合成，从而在过量表达的转基因植株中呈现生物量增大的表型。BoCYP83B1和BoTGG1在过量表达的转基因植株中呈现出开花时间改变的表型，尽管目前分子机制尚不完全清楚，但证明了芥子油苷代谢与植物开花的密切关系。尤其是BoTGG1的过量表达可提高转基因植株对细菌性病原菌PstDC3000的气孔防御能力，同时可延迟花期并导致生物量的提高。在众多十字花科蔬菜中高产、抗病和晚抽薹均为重要的育种目标，而芥子油苷代谢在十字花科植物中有较高的保守性，因此，BoTGG1在培育高产、抗病防止提前开花的育种工作中具有潜在的应用价值，在理论和生产实践中均具有重要意义。