EETs对于早期椎间盘退变中髓核细胞增殖及ECM代谢的作用及其机制的研究

Epoxyeicosatrienoic acids (EETs) is a metabolite of the arachidonic acid (arachidic acid) in the organism, and it is divided into four subtypes. In recent years, the important role of EETs in the body has been gradually clarified, and the different subtypes of EETs, because of their chemical structure differences, the efficacy is not the same. Due to the great potential of EETs targeting therapy, a number of studies of different subtypes of EETs are in progress. However, the effect of EETs on the nucleus pulposus and extracellular matrix (ECM) in the early degeneration of intervertebral disc is not clear. We found that 14,15-EET delayed the early intervertebral disc degeneration by acting on the anti-inflammatory and antioxidant effects of the nucleus pulposus cells, the effect of other types of EETs has not been elucidated. According to the applicant's opinion, because of the difference in chemical structure of each type of EETs, it also has different effects on nucleus pulposus cells and ECM in degenerative intervertebral disc. This paper intends to use the nucleus pulposus cells of inflammation and oxidative stress in rat model, focusing on the effects and molecular mechanisms of various types of EETs in intervertebral disc degeneration; and using the rat tail disc degeneration animal model, to explore the potential role of EETs type of intervertebral disc degeneration; in order to early intervertebral disc degeneration the target is to provide the theoretical basis of medication.

生物体内花生四烯酸经过不同代谢途径生成前列腺素和表氧化二十碳三烯酸（EETs），EETs又分为四个亚型。近年来，EETs在体内的重要作用逐渐被阐明，而不同亚型的EETs，因其化学结构存在差异，作用及功效也不尽相同。由于EETs靶向治疗的巨大潜力，对于不同亚型的EETs的多项研究也正在进行中。而EETs对椎间盘早期退变中髓核细胞及胞外基质（ECM）的影响尚未阐明。前期研究发现14,15-EET具有延缓早期椎间盘退变的作用，但其他分型的EETs的作用功效尚不明确。申请人认为，由于各分型的EETs存在着化学结构上的差异，其对于退变椎间盘中的髓核细胞及ECM的亦会产生不同的影响。本课题拟采用大鼠髓核细胞炎症及氧化应激模型，重点探讨各类分型EETs在椎间盘退变中的作用及分子机制；并运用大鼠尾椎间盘退变动物模型，探讨各分型EETs对椎间盘退变的潜在的作用；以期为椎间盘早期退变的靶向用药提供理论依据。

EETs是花生四烯酸代谢产物 ，分为四个亚型。近年来，EETs在体内的重要作用逐渐被阐明，而不同亚型的EETs因其化学结构存在差异，作用及功效也不尽相同。由于EETs靶向治疗的巨大潜力，对于不同亚型的EETs的多项研究也正在进行中。而EETs对椎间盘早期退变中髓核细胞及胞外基质（ECM）的影响尚未阐明。.本研究中，我们通过取周龄为12-14周的雄性SD大鼠，分离并培养大鼠髓核细胞；采用CCK-8方法检测不同浓度的5,6-EET、8,9-EET、11,12-EET对髓核细胞增殖的影响；我们通过流式细胞法检测5,6-EET、8,9-EET、11,12-EET保护后对TNF-α及H2O2诱导的髓核细胞的抗凋亡能力；采用Western Bloting免疫蛋白印迹法，实时定量RT-PCR的方法检测5,6-EET、8,9-EET、11,12-EET对TNF-α及H2O2诱导的髓核细胞中Ⅰ型胶原、Ⅱ型胶原，聚集蛋白聚糖以及MMPs的表达水平的影响；采用Western Bloting的方法检测11,12-EET对NF-κB、MAPKs、PI3K/Akt信号通路中关键蛋白的的影响；.通过体外和体内实验，我们观察到EETs抑制椎间盘退变抗凋亡的作用，与促进了细胞外基质中Agg和Col-Ⅱ的产生，以及减少了Col-Ⅰ和基质金属蛋白酶的水平有关。我们发现在MAPKs的3个亚家族中，p38、ERK及JNK在TNF-α诱导后表达都有不同程度的升高，而11,12-EET抑制了这一变化；同时11,12-EET可以激活PI3K/Akt信号通路，抑制AKT的活性；其可以通过抑制p-P65的表达抑制NF-κB信号通路的激活。.通过研究各5,6-EET、8,9-EET、11,12-EET在早期椎间盘退变中的作用，我们发现各亚型EEsT对于炎性及氧化应激环境下的髓核细胞均具有一定的保护作用，其能够抑制细胞外基质的重塑，并通过多条信号通路发挥抗炎症的作用，这一发现也为椎间盘退变提供安全、准确、高效的预防及靶向治疗的新思路。随着精准医疗和微创外科技术的不断提高与发展，本研究结果不仅一定程度的阐明EETs这一类内源性生物小分子在椎间盘退变发生、发展中的作用效果，同时针对这一靶点开发新的治疗药物，为满足精准医疗和微创医学需求都具有重要意义。