芥子油苷代谢中microRNA的鉴定与功能分析

芥子油苷代谢与植物防御反应密切相关，且某些芥子油苷的降解产物具有很高的抗肿瘤活性，因而其代谢及调控机制的研究备受关注。生物信息学计算和我们的初步研究结果表明芥子油苷代谢途径中存在miRNA水平的调控机制。本研究将以模式植物拟南芥为实验材料，从目前已经鉴定的芥子油苷合成与分解相关基因入手，根据最新的数据库资源和生物信息学计算获得靶向于芥子油苷代谢基因的候选miRNA, 进行实验室的分离与鉴定工作。拟采用特殊的茎环RT-PCR和Northern 杂交方法检测miRNA的表达并通过检测miRNA特异性的剪切酶DCL1的突变体中miRNＡ前体累积和成熟miRNA的减少，进一步确认miRNA的真实性。靶基因的鉴定主要通过5′RACE方法检测miRNA对靶基因的剪切片段。初步分析经过鉴定的miRNA在芥子油苷代谢调控中的作用，揭示芥子油苷代谢中miRNA水平上的调控机制。

芥子油苷是十字花科植物中特有的一种次生代谢产物，其降解产物与植物抗虫和抗病性密切相关，且某些芥子油苷降解后对人类具有很强的抗癌活性，因此其代谢调控的研究倍受关注。 . 本研究分离并鉴定了一个与芥子油苷合成及生长素合成密切相关的miRNA，命名为miRNAID-9.MiRNAID-9靶向于吲哚族芥子油苷合成酶SUR1的编码基因，可在特定位点对SUR1基因的mRNA进行剪切，从而抑制SUR1基因的表达，其时空表达模式与SUR1是一致的。MiRNAID-9在正常生长条件下表达量极低，高温处理后表达增强，过量表达miRNAID-9呈现出显著表型：芥子油苷含量降低、生长素含量增高，形态学上表现为根显著增粗、叶柄直立、开花期显著提前。miRNAID-9功能缺失突变体的表型与过表达相反。经鉴定，miRNAID-9的生理功能是：在高温下被诱导，通过抑制SUR1基因的表达，使SUR1的催化底物IAOx累积，由于IAOx同时是生长素IAA的前体物质，miRNAID-9的表达可促进生长素的合成并诱导植物开花。由于芥子油苷和生长素的合成途径以SUR1的底物IAOx为交叉点，因此miRNAID-9对SUR1的调控是影响植物初生代谢与次生代谢之间合理转换的重要因素。. 本项目的实施参照任务计划书执行，顺利地完成了研究内容，达到了预期的研究目标。. 尽管生物信息学的预测表明植物基因组中存在大量的miRNA，尤其在模式植物拟南芥中已经预测了大量的miRNA, 但到目前，通过实验验证的miRNA比例相对很少，主要原因是这些未知的miRNA在表达上具有很强的时空特异性，在正常生长条件下不表达或表达量很低，这给鉴定工作带来了极大的难度。本研究成功地鉴定一个在芥子油苷合成和生长素合成过程交叉点起重要调控的miRNA，对深入理解植物初生代谢与次生代谢之间的关系及相互转化提供了重要线索。