"小檗碱与氟康唑"协同抗耐药白念珠菌的"液泡"机制研究

耐药性是长期困扰药物疗效的严重问题，白念珠菌耐药已成为抗真菌治疗失败的最主要原因。我们在国际上首次发现"氟康唑（FLU）+小檗碱(BBR)"具有强大的协同抗耐药白念珠菌作用，但协同的关键环节尚未阐明。前期细胞超微结构观察、膜甾醇成分分析、协同抗菌谱和BBR细胞内定位的结果提示: FLU通过破坏液泡膜完整性使BBR从液泡中泄露可能是两药协同的关键环节。本项目拟全面考察液泡机制在"FLU+ BBR"协同抗真菌中的作用。①应用透射电镜和激光共聚焦技术研究BBR蓄积于液泡的量效和时效关系；②考察"FLU+BBR"合用时，液泡膜完整性及BBR细胞内分布的改变；③通过药敏实验证明是否所有且唯有破坏膜结构的药物能协同BBR抗耐药白念珠菌；④运用基因敲除技术制备液泡缺陷菌，考察液泡缺陷是否导致白念珠菌对BBR敏感。本项目的实施可以为发现"FLU+ BBR"协同的靶标、完善耐药理论、研发抗真菌新药奠定基础。

本课题组前期研究发现氟康唑与小檗碱合用具有强大的协同抗氟康唑耐药白念珠菌的作用，本研究旨在研究两药协同的机制，阐明两药在协同过程中各自的作用。我们应用激光共聚焦显微镜系统地考查小檗碱的细胞内定位，研究发现小檗碱蓄积于细胞核而不是先前预计的液泡；氟康唑与小檗碱的协同效果与小檗碱呈剂量依赖关系,而与氟康唑的浓度关系不大，提示小檗碱发挥主要作用，是 “君药”，而氟康唑可能是“臣药”；与小檗碱定位于细胞核相符的结果还包括：两药合用导致细胞周期阻滞于S/G2期；基因芯片结果表明两药合用可导致细胞周期及DNA代谢相关基因表达显著变化；除小檗碱外的DNA嵌合剂，如亚甲蓝，血根碱和吖啶橙也能与氟康唑协同；合用氟康唑能显著增加细胞内小檗碱的浓度；利用透射电镜我们发现即使是对氟康唑耐药白念珠菌，氟康唑仍能一定程度地破坏细胞膜，从而方便小檗碱进入细胞内，导致细胞内小檗碱浓度升高；其他破坏细胞膜的药物，如酮康唑、伊曲康唑和两性霉素B均能协同小檗碱抗耐药白念珠菌。总之，我们应用荧光探针、细胞生物学、分子生物学和工具药的方法证明小檗碱定位于细胞核，造成细胞周期阻滞，发挥主要的抗白念珠菌作用，氟康唑通过破坏细胞膜增加细胞内小檗碱的含量，发挥辅助抗菌作用，上述工作发表于Antimicrob Agents Chemother。由于上述研究表明小檗碱并非定位于液泡，在基因敲除和功能研究阶段我们调整了研究策略，没有进一步敲除液泡相关基因，而是选取了与白念珠菌致病性和凋亡相关的ECM17 、HSP90、CAP1等基因，相关工作发表在Fungal Genet Biol、FEBS J和PLoS One。除小檗碱外，我们还发现了其他数个具有抗真菌活性的天然产物单体，紫檀茋和汉防己甲素抗真菌生物被膜的新用途申请了两项发明专利，汉防己甲素相关工作发表在PLoS One，紫檀茋相关工作投稿到Antimicrob Agents Chemother后得到了正面的审稿意见，文章已经修回。在上述工作开展期间，我们还对抗真菌药效评价的动物模型做了有益的探索，文章发表在Biol Pharm Bull和Adv Biochem Eng Biotechnol。 该项目在抗真菌协同机制方面有新的发现，相关各方面的工作为开展抗真菌新药研发奠定了工作基础。