基于固定化磷脂酰丝氨酸多肽配体的细胞外囊泡的分离及人参皂苷Rd诱导肿瘤细胞凋亡分泌的细胞外囊泡的脂质学研究

Extracellular vesicles (EVs) are spherical particles enclosed by a phospholipid bilayer and shed from various types of cells, including tumor cells. It main contain lipids, proteins, RNAs, microRNAs (miRNA), and some cytoplasmic organoids which are similar with their parent cells. Now it acts as vectors of information that regulate the function of target cells. EVs has become a promising source of biomarkers, much effort has been devoted to their collection. Moreover，It is important to highlight the characterization of the lipidomics of EVs released from the tumor cell induced by the effective components in Chinese traditional medicine. In this study, we aimed to develop a simple method of collecting EVs and analyze their lipids of EVs. A common feature of EVs is that they have phosphatidylserine moieties present on the outer surfaces of their membranes. Therefore, we took advange of a phosphatidylserine-binding peptide ligand, PS-peptide, to generate a PS-peptide modified silica (SiO2@PS-Peptide) microsphere -based procedure to capture EV. This method is simple yet powerful for the isolation EVs from cell culture medium. The structure of EVs would not be demaged, and the purity of EVs would be enhanced. With the aid of the recent advent of the profiling method of lipidomics and the isolation method of EVs raised by our research, more information about endogenous lipids of EVs released from apoptotic MCF-7 tumor cell treated with Ginsenoside Rd could be gain to help finding the common and specific biomarkers among the diseases. As a result, it is significant for extension of capture EVs method, and exploring the mechanism of inducing cancer cell apoptosis.

细胞外囊泡(EVs)是一种由细胞分泌的脂质双分子层包绕的超微囊性结构，是一个很好的非侵入性的生物标志物的来源所在。利用脂质组学发现其中的生物标志物具有事半功倍的效果，但EVs的分离目前存在很多问题，且中药活性物质诱导肿瘤细胞凋亡产生的EVs中脂质组学的研究较少。鉴于大多数EVs表面存在磷脂酰丝氨酸(PS)的特点，本研究拟制备一种PS多肽配体修饰的二氧化硅微球（SiO2@PS-Peptide），该微球能通过PS多肽配体与EVs表面PS间的特异性相互作用，选择性地将EVs从细胞培养液中捕获分离出来。该方法具有操作简单，对EVs结构无破坏，易于除去背景干扰等优点。然后将捕获的EVs结合脂质组学技术，比较人参皂苷Rd诱导肿瘤细胞凋亡时分泌的EVs中脂质轮廓谱变化，发现EVs中存在的新颖独特的生物标志物。本项目对于EVs的捕获，和探索人参皂苷Rd诱导肿瘤细胞凋亡的机制研究都将提供一个全新的途径。

细胞外囊泡(EVs)，特别是其中的外泌体(Exo)是一种直径范围在50-200nm且具有双层脂质膜结构的扁平球体小泡，外泌体携带多种生物活性物质，如核酸、蛋白质和小分子代谢物等，已成为肿瘤疾病诊断相关的新颖、独特、潜在的生物标志物来源。快速、高效地从体液或者组织中获取外泌体是外泌体研究和应用的前提。.本研究针对外泌体分离开展了系统的研究，主要内容包括：（1）磷脂酰丝氨酸(PS)多肽配体的固定化；（2）固定化PS多肽配体的二氧化硅微球（SiO2@PS-Peptide）微球对小分子PS特异性吸附的验证；（3）SiO2@PS-Peptide微球对细胞模型外泌体捕获新方法的建立；（4）SiO2@PS-Peptide微球对复杂血清样品中外泌体的分离；（5）基于新建立的方法，对胆管癌等临床样品血清外泌体中蛋白质组学和脂质组学分析；（6）中药人参皂苷和黄芪多糖等分别于肿瘤细胞后对细胞释放外泌体的蛋白质组学和脂质组学分析。.本研究基于外泌体双层膜外表面富含PS分子的特点，将PS多肽配体分子固定化在SiO2表面，并通过SEM、FT-IR、Zeta电势等方法验证了多肽配体的成功固定化，制备了SiO2@PS-Peptide新型功能化材料。通过模型外泌体验证了SiO2@PS-Peptide微球对外泌体的特异性吸附作用，建立了基于SiO2@PS-Peptide微球分离纯化外泌体的新方法，证明了SiO2@PS-Peptide微球能够捕获分离外泌体且不破坏外泌体的囊泡结构；进一步将新建的方法应用于血清样品中外泌体的分离，证明新方法操作过程简单，产率高，成本低，有望用于大样本的高通量分析。基于新建立的方法，从健康对照组、肝细胞性肝癌和胆管癌患者组的血清中提取外泌体，开展了外泌体蛋白质组学研究；针对胆管癌开展了脂质学研究，比较胆管癌血样与血样来源外泌体样本脂质代谢物差异；开展了中药人参皂苷、黄芪多糖等作用于不同肿瘤细胞，绘制了肿瘤细胞分泌的外泌体蛋白或脂质代谢谱，发现了外泌体特异性生物标志物，并对代谢通路和作用机理等进行了探讨。.本研究很好地完成了预期目标，成功制备了捕获外泌体的新材料，并开发了细胞、血清等生物样品中捕获外泌体的新方法，最后将该方法与组学结合，分析了临床血清样品、中药干预的肿瘤细胞样品中外泌体的蛋白质组或脂质组学，为发现外泌体中独特生物标志物提供了新思路和新方法。