基于两个显性非综合征性耳聋大遗传家系的新致聋基因克隆与功能研究

Identification and functional studies of novel deafness genes is important for understanding the molecular mechanism of auditory system and the molecular pathogenesis of hearing impairment. Previously we recruited two large autosomal dominant families segregated with deafness. Using targeted exon capture and sequencing, we excluded the possibility of causative mutations in known non-syndromic deafness genes. This suggested that the deafness in our families is very likely caused by mutations in novel deafness genes. By whole genome linkage analysis using the SNP microarray, we localized the disease-causative gene in one family to chromosome 4q34 (maxium LOD score 3.2), a novel locus without any previously reported deafness genes. In this study, we proposed to identify the causative genes and their corresponding mutations by linkage analysis (for the other family), targeted capture and next-generation sequencing. Functional studies of the causative gene, including gene expression studies, gene interation studies and transgenic mouse model studies, is proposed to explore their roles in the hearing function pathways and in the molecular pathogenic mechanism. This study may provide importance insights into the molecular mechanism of auditory system and the molecular pathogenesis of hearing impairment.

耳聋新基因的克隆与功能研究是聋病分子生物学领域的热点研究方向，近年来引领和推动着听觉及聋病分子机制研究方面的不断进展。在前期工作中，本课题组收集到两个极具研究价值的常染色体显性非综合征性耳聋大遗传家系，并针对所有63个已知的非综合征性耳聋基因进行了目标基因外显子捕获及测序，排除了已知耳聋基因外显子突变致聋的可能性，说明这两个家系的耳聋很有可能是由未知新耳聋基因所导致。通过全基因组SNP芯片连锁定位分析，我们已将其中一个家系的致病基因定位于染色体4q34区域（最大LOD值3.2），此区域不包含任何已知耳聋基因。本课题拟利用连锁定位分析（另一家系），并结合靶向捕获及二代测序等方法发现所收集家系的致聋基因及突变；通过基因表达分析、基因相互作用研究、转基因小鼠模型研究等手段对所克隆新致病基因进行基因功能性研究，以明确相关的听觉功能途径和分子致病机理。

耳聋新基因的克隆与功能研究可极大的推动对听觉及聋病分子机制的理解。在本项目中，课题组运用耳聋基因二代测序等技术对大量遗传性耳聋病例及家系样本进行了已知耳聋基因突变排查，发现两个常染色体显性非综合征性耳聋大遗传家系很有可能是由未知新耳聋基因突变所导致。通过全基因组SNP芯片连锁定位分析，我们将这两个家系的致病基因分别定位于染色体16p13.3（最大LOD值3.8）和15q21.2（最大LOD值4.0）区域，进而运用全外显子测序技术发现唯一与家系听力表型共分离的TBC1D24基因p.S178L突变和DMXL2基因p.R2417H突变，生物信息学分析显示有较大可能为致病性突变。课题组在细胞中成功外源表达了野生型及突变型TBC1D24基因，发现野生型TBC1D24可在一定程度上促进COS7细胞和大鼠大脑皮层神经元原代细胞的树突状分支和延伸，而p.S178L突变型TBC1D24可导致该树突状分支和延伸能力的异常性增强，提示p.S178L突变有可能是一个功能获得性突变。通过不同发育时期小鼠内耳基因表达研究及组织学免疫荧光染色，我们发现Tbc1d24基因在螺旋神经节神经元有持续性表达，而Dmxl2基因特异性表达于毛细胞近基底膜侧及神经纤维末梢近毛细胞侧，和听觉神经突触活跃区域重合。结合既往研究报道，我们的结果显示TBC1D24和DMXL2基因可能与听觉突触功能及病变相关。运用CRISPR-Cas9技术，课题组成功构建了Tbc1d24基因p.S178L突变敲入小鼠和Dxml2基因p.R2417H突变敲入小鼠，听觉生理学研究显示这两个小鼠模型均具有和人类病例类似的迟发性、进行性听力障碍，显微病理学研究显示Tbc1d24基因突变小鼠在8月龄有显著的耳蜗螺旋神经及毛细胞损失。总体而言本项目完成情况良好，在Genetics in Medicine、Human Mutation等知名学术期刊发表基金标注SCI论文4篇，总影响因子20.9分，所发现的两个新耳聋基因在分子水平上促进了对听觉基础和相关聋病发病机制的理解，为相关遗传性耳聋更精准的诊断、预防和治疗提供良好的参考依据。