川芎嗪通过miR-199a-5p诱导自噬介导缺血脑卒中神经保护作用的机制研究

Stroke is a common and frequent health-threatening illness of human beings, especially for the aged and the middle-aged people, and there is no effective therapy method. Hot and difficult spot lies in new therapy and efficient interfere strategy in nerve science research field. Ischemic stroke has a very complex pathophysiology. Most research focus on the mechanism of nerve death after ischemia. In contrast, regulations of cell survival mechanisms have been less studied. Autophagy, though as an important balance mechanism affecting cell survival, its role in stroke is still in dispute. Our preliminary experiments indicate that there are autophagy inducement deficiency and higher expression of miR-199a-5p in injury cerebral tissues. Meanwhile, tetramethylpyrazine performs neuroprotective effects on cerebral ischemia reperfusion injury in vivo animal models and in vitro cell experiments. Hence, it is necessary to further research the effects of tetramethylpyrazine on miR-199a-5p and autophagy. Our project aims to demonstrate the role of autophagy in ischemic stroke, to elucidate the regulation of miR-199a-5p on autophagy, to explore the mechanism of neuroprotective effects of tetramethylpyrazine through the regulation of autophagy via miR-199a-5p. We will provide new treatment target for stroke and cast a new light on the molecule mechanism of tetramethylpyrazine curing this disease.

脑卒中是威胁人类尤其是中老年人健康的常见病、多发病，且缺乏有效的治疗手段。寻找新的治疗方法和有效的干预策略是当今神经科学领域研究的热点和难点。缺血性脑卒中存在复杂的病理机制。多年来，科学家主要集中研究缺血后神经死亡机制，而对细胞存活的调控机制研究较少。自噬（autophagy），作为一种重要的影响细胞存活的机制，其在脑卒中的作用仍存争议。我们前期预实验发现，缺血再灌注损伤脑组织自噬发生不足，而miR-199a-5p高表达。同时，体内外实验表明，川芎嗪对缺血再灌注损伤具有神经保护作用。那么，川芎嗪是否影响miR-199a-5p和自噬值得进一步研究。本项目旨在明确自噬在脑卒中所扮演的角色；阐明miR-199a-5p调控自噬的作用机理；探讨川芎嗪通过影响miR-199a-5p及自噬发挥神经保护作用的机制。本项目完成有助于为脑卒中治疗提供新的作用靶点，为研究川穹嗪治疗脑卒中的分子机制提供新的思路。

脑卒中已成为当今社会致残致死的主要病因之一，目前缺乏有效的预防和治疗措施。miRNAs在缺血性脑卒中的发病机制中发挥重要的作用。最近，自噬在缺血性脑卒中扮演的角色引起了人们的极大关注。川芎嗪在临床上广泛应用于治疗和预防缺血性脑卒中，其发挥神经保护效应是否与自噬及miRNAs功能有关，值得深入研究。本项目分析了缺血性脑卒中患者血清中差异表达的miRNAs。通过构建大鼠脑缺血再灌注损伤模型（MCAO）和PC12细胞损伤模型进一步探讨miR-199a-5p、miR-106b-5p、自噬在脑缺血再灌注损伤中所扮演的角色。体内外实验研究miR-199a-5p和miR-106b-5p的生物学功能（自噬、凋亡、氧化损伤及炎症等）。综合运用多种分子生物学技术，在分子、细胞和动物层面深入研究川芎嗪和电针改善脑缺血再灌注损伤的作用机理。我们发现：（1）急性缺血性脑卒中患者血清存在一系列差异表达的的miRNAs，其中miR-199a-5p和miR-106b-5p显著升高。（2）体内外结果表明miR-199a-5p和miR-106b-5p在MCAO大鼠脑组织、PC12损伤模型细胞均高表达。相反，自噬低表达。（3）体外实验发现miR-199a-5p促进凋亡，抑制自噬，参与mTOR信号通路、神经营养因子通路等信号通路。可通过调控BECN1、Rheb靶基因影响自噬的发生。miR-106b-5p可参与细胞凋亡、氧化应激等多种重要的生物学过程。（4）动物模型数据提示miR-106b-5p抑制剂可通过减轻氧化应激损伤和抑制细胞凋亡明显减轻脑缺血再灌注损伤。（5）TMP 治疗可显著改善脑缺血再灌注损伤，其机制可能为抑制miR-199a-5p 的表达，诱导自噬，减少凋亡，降低炎症反应。（6）电针治疗脑缺血再灌注损伤与ERK1/2信号转导有关，其通过激活ERK1/2通路调控抗氧化及抗凋亡相关基因表达及酶活性的途径而实现电针的脑保护机制。（7）电针联合川芎嗪可能通过上调miR-146a的表达，抑制TLR4/NF-κB信号通路，减轻脑缺血后炎症损伤。总的来说，这些研究为缺血性脑卒中提出了新机制及药物作用靶点，为研究防治缺血性脑卒中的新药提供了新思路。