牛卵泡可卡因-苯丙胺调节转录肽（CART）受体的鉴定及其调控机理研究

Bovine follicular development and ovulation number are the two most important factors influencing the application of embryo biological technology and propagation of cattle with excellent genetic traits. Our previous data indicated that CART, as neuropeptide, played a negative role in regulating the proliferation of granulosa cells and estrogen (E2) secretion of bovine follicles. However, little is known about the CART receptor and their function and regulation mechanism. In this proposal, we will firstly identify CART receptor by immune affinity chromatography, immunity electronic microscope and surface plasmon resonance. The function of CART receptor will then be determined by overexpression and CRISPR-Cas9 knockout. Our results will clarify the regulatory mechanism of CART mediated reproductive hormones, intracellular factors and key proteins in the pathway of bovine follicular development and will enrich the regulation theory of follicular development and dominance. Furthermore, the proposed study will aid the analysis crystallization and three-dimensional structure of CART receptor and the drug engineering related to follicular development.

牛卵泡发育及排卵数量是胚胎生物技术应用和优良种畜扩繁的限制因素。课题组前期研究表明，神经肽可卡因-苯丙胺调节转录肽（CART）对牛卵泡颗粒细胞增殖及雌激素（E2）分泌有显著的负调控作用。但CART受体仍未鉴定，其功能及作用机理尚不清楚。本项目重点通过免疫亲和层析和表面等离子共振等技术鉴定CART受体；采用基因敲除和过表达细胞模型明确受体功能。项目完成后，可从根本上阐明调控牛卵泡发育通路中，神经肽CART调控生殖激素、细胞内因子及关键蛋白表达的作用机理。该研究成果对丰富卵泡发育及优势化调控理论具有重要意义，为后续受体结晶和立体结构解析、以及调控卵泡发育相关药物的筛选和应用奠定基础。

牛在一个发情期内一般仅有一个卵泡排卵，卵母细胞来源严重制约胚胎工程迅速发展。可卡因-苯丙胺调节转录肽（Cocaine-and Amphetamine-Regulated Transcript Peptide, CART）是负调控牛卵泡发育的神经肽，其通过结合卵泡颗粒细胞（Granulesa Cells, GCs）膜上的G蛋白偶联受体（G Protein-Coupled Receptors, GPCRs），将信号传递到胞内抑制GCs增殖和雌激素（Estrodiol, E2）分泌，进而引起卵泡闭锁。本研究通过生物膜干涉技术证明GCs膜上存在CART的受体；应用跨膜蛋白抽提和免疫亲和层析技术获得与CART互作的蛋白复合体；Label-free蛋白质组分析获得蛋白149种、557种和298种，通过蛋白亚细胞定位及跨膜次数分析，共获得7个GPCRs；经亲、疏水性、结合位点、蛋白同源建模及分子对接，将ZMPSTE24与前期筛选获得的AGTR2、TEDDM1、CMKLR1共4个GPCRs作为CART候选受体；通过GCs体外培养和RNAi技术分别沉默CART候选受体进行功能研究，CCK-8 Kit和ELISA法分析各组GCs增殖及培养液E2浓度，结果显示：各组细胞增殖率和培养液中E2浓度与对照组差异不显著（P>0.05）；采集牛发情周期优势和从属卵泡，分离GCs并提取总蛋白，胰酶酶解后LC-MS/MS进行蛋白质组分分析，共鉴定出3409种蛋白质（FDR≤0.01），其中，获得优势和从属卵泡特异性表达蛋白分别为236和443个，获得差异表达蛋白259种；构建了CART相互作用网络，筛选出受体介导的CART下游通路关键调控蛋白。该研究结果为深入了解牛卵泡闭锁提供理论支持，丰富了动物生殖生理学中下丘脑—垂体—卵巢轴的内分泌调控理论，对单胎动物胚胎生物技术实施和优良种群扩繁具有重要意义。