针刺通过mTOR介导细胞自噬对脑出血大鼠神经保护作用及机制研究

Intracerebral hemorrhage about 75% survivors have severe neurological deficits, and so far, there is no effective treatment to improve the prognosis. Our previously studies found that: acupuncture can promote autophagy by mTOR signaling pathway to improve neurological deficit signs of intracerebral hemorrhage rats. In order to explore the possible mechanism of acupuncture on intracerebral hemorrhage, this research intends to use electron microscope, immunofluorescence, Western, PCR, adeno-associated virus and other techniques, using intracerebral hemorrhage rat model induced by autologous blood, by inhibiting autophagy level and adeno-associated virus mediated mTOR gene interference, to study the effect of protein expression which acupuncture on autophagy associated protein (LC3, LAMP1/2) and mTOR pathway (p-mTOR, p-ULK1) after intracerebral hemorrhage. In-depth interpretation of the mechanism of autophagy after intracerebral hemorrhage as well as the possible material basis and the effective target of acupuncture relieves nerve injury after intracerebral hemorrhage through mTOR signaling molecular mechanism, to test and verify the scientific hypothesis of “the mechanism of acupuncture intervention- inhibit mTOR signaling pathway- induce different types of neuronal autophagy- initiate nerve cell self-repair- achieve nerve repair and remodeling after intracerebral hemorrhage”, and provide new scientific basis for intracerebral hemorrhage treatment in the future.

脑出血约75%的幸存者存在严重的神经功能缺损，但到目前为止，没有有效的治疗方法证实可以改善预后。我们前期发现：针刺可通过mTOR通路促进细胞自噬改善大鼠脑出血神经功能缺损体征。为探究针刺治疗脑出血可能机制，本项目拟采用电镜、免疫荧光、Western、PCR、腺相关病毒技术，以大鼠自体血诱导脑出血模型为研究对象，通过抑制自噬水平，腺相关病毒介导mTOR基因干扰，研究针刺对脑出血后自噬相关蛋白（LC3、LAMP1/2）及mTOR通路（p-mTOR、p-ULK1）蛋白表达的影响。从mTOR信号分子作用途径深入阐释脑出血后细胞自噬作用机制及针刺减轻脑出血后神经损伤的可能物质基础与有效作用靶点，进而验证“针刺干预-抑制mTOR信号通路-诱导不同类型神经细胞自噬激活-启动神经细胞自我修复-达到脑出血后神经修复与重塑的作用机制”科学假说，为针刺治疗脑出血提供新科学依据。

脑出血中自噬的激活可能是为了清除胞质中有害物质和受损细胞器的一种自我保护机制，但是过度激活自噬可能导致细胞死亡。因此，本项目通过制备脑出血大鼠模型，运用电镜、免疫荧光双标、Western Blot等技术，以mTOR信号通路的分子作用途径为切入点，通过动态观察针刺对脑出血后不同类型神经细胞自噬的影响，深入阐释脑出血后神经细胞自噬的作用机制以及针刺减轻脑出血后神经损伤的可能物质基础与有效作用靶点。结果表明：1.针刺可以改善脑出血大鼠神经功能缺损体征；2.针刺可以促进大鼠脑出血后自噬相关蛋白LC3A/B和p62的表达；3. 针刺可以抑制大鼠脑出血后小胶质细胞自噬，促进神经元、星形胶质细胞自噬；4. 针刺可以调控mTOR信号通路中p-mTOR、p-ULK1、TFEB、DAP1蛋白含量的表达；5. 针刺可能通过调控mTOR信号通路对脑出血后神经细胞自噬起到良性调节作用。结论：针刺可能通过调节mTOR信号通路的关键蛋白，抑制小胶质细胞自噬，促进神经元、星形胶质细胞自噬，维持神经细胞自噬的适度激活，进而保护神经细胞、促进神经细胞自我修复，进而验证了“针刺干预-抑制mTOR-ULK1- DAP1- TFEB信号通路-诱导不同类型神经细胞适度激活-启动神经细胞自我修复-达到脑出血后神经修复与重塑的关键作用机制之一”的科学假说。为针刺治疗脑出血提供了全新的科学依据，为脑出血的治疗研究拓宽了思路。