Bt染色体重组PuGV-Ps增效蛋白基因的表达及其增效作用研究

苏云金杆菌（Bt）是研究应用最为广泛的生物杀虫剂，实际使用中存在作用速度慢、杀虫谱窄、防效不稳定等弱点。增效蛋白（Enhancin）昆虫病毒基因编码的增效因子，能提高Bt、核型多角体病毒（NPV）等昆虫病原微生物的毒力。本项目以Bt和转东方粘虫属主粘虫颗粒体病毒（PuGV-Ps）增效蛋白基因为材料，利用转座子介导的基因重组方法将截短优化的PuGV-Ps增效蛋白基因整合到Bt染色体上，构建稳定表达重组蛋白、无抗性标记基因的增效Bt工程菌，为充分利用增效蛋白的协同增强效能、构建双价抗虫效果的工程菌提供新的思路和方法。主要研究：①PuGV-Ps增效蛋白基因的短截优化及基于转座子衍生载体的整合质粒构建。②增效蛋白基因重组质粒在Bt菌株中的转化和重组转化子的筛选。③增效基因Btz转化菌株增效蛋白、Bt毒素蛋白的表达及杀虫增效活性测定。④增效蛋白基因在Bt染色体中的重组位点及表达蛋白对Bt增效机制。

苏云金杆菌（Bt）实际使用中存在作用速度慢、防效低等弱点。增效蛋白（enhancin）是昆虫病毒基因编码的增效因子，能提高Bt、核型多角体病毒（NPV）等昆虫病原物的侵染能力。本研究以Bt和转东方粘虫属主粘虫颗粒体病毒（PuGV-Ps）为材料，利用转座子介导的基因重组方法构建重组蛋白基因的增效Bt工程菌。主要结果如下：.1、克隆和分析了PuGV-Ps增效蛋白的全长基因.以PuGV-Ps的DNA为模板，扩增出2.7 kb的特异性片段。构建重组质粒pET15b-En；测序证明是增效蛋白的全长基因。与原始PuGV增效蛋白基因序列比较，突变碱基集中在5’端，说明3’端是基因的保守区域。.2、原核表达了PuGV-Ps 增效蛋白并测定其增效活性.增效蛋白基因的重组质粒pET15b-En转化到大肠杆菌中， IPTG诱导表达了108 kD的表达产物。0.2%的葡萄糖有利于基因表达。表达产物具有增效活性，随表达量的增加作用更为显著。.3、进行了PuGV-Ps增效蛋白基因的短截优化.PCR扩增P46（1.3kb）、P69（2.1kb）和P83（2.5kb）截去5′端及p77截去3′端短截片段（2.3kb）。pET-15b中插入短截片段并转化到Top-10中，P69和P77获得表达。P77无增效活性，进一步说明3’端是基因的功能区。.4、构建了PuGV-Ps增效蛋白基因整合载体pLTV1-En.酶切线性化含有转座子Tn917的质粒pLTV1，连接增效蛋白基因后转化Top10获得克隆子，XhoⅠ和NheⅠ双酶切验证插入位点和方向正确。测序证明获得增效蛋白基因整合载体pLTV1-En。.5、构建了Bt染色体重组增效蛋白基因工程菌Bt2671-En.电击转化pLTV1-En到Bt2671中，筛选获得增效蛋白基因转化菌株；高温转接得到增效蛋白基因整合到Bt染色体上的整合子，构建了增效Bt工程菌Bt2671-En，杀虫活性较出发菌株提高了10.4%。.6 探明了PuGV-Ps增效蛋白对Bt毒力的增强作用机理.扫描电镜观察了PuGV-Ps增效蛋白对围食膜蛋白降解作用，使围食膜通透性增强。Bt同样影响了PM蛋白的结构，PM上29 kD的蛋白是PuGV-Ps增效蛋白和Bt的共同靶蛋白。