单细胞遗传分析仪研制

A single cell is the atomic unit of function and evolution for the lives on our planet. Thus single-cell genomics is able to explore, with unprecedented depth, sensitivity and throughput, fundamental questions such as “mechanism of heterogeneity in life” and “unculturable microbes”. The “Raman-activated Cell Sorter (RACS)” previously developed by us is able to screen and isolate unlabeled single-cells based on their biochemical profiles. Here we propose to develop “Single-cell Genetic Analyzer (SGA)”, which realizes and integrates nucleic acid isolation, amplification and sequencing-library preparation based on the sorted single-cells on a microfluidic chip. By coupling cell sorting and DNA-sequencing, the instrument enables single-cell sequencing of 16S/18S, genome and transcriptome, thus allowing simultaneous phenotyping and genotyping of single-cells (or cellular communities) with high throughput. The key challenges include DNA/RNA amplification strategies, surface adhesion in the amplification reaction, integration of cell lysis and nucleic acid isolation/amplification, optimization of single-cell reaction system, and seamless integration to the cell sorters (RACS or FACS) upstream and the sequencers (e.g. 454 Titanium and Illumina Hi-Seq) downstream. The SGA expands the reach of modern omics technologies to the “deepest” level of individual single-cells and is widely applicable to both prokaryotic and eukaryotic (including human) cells. Thus the instrument solves a crucial and shared bottleneck in the technological paradigm of Single-Cell Analysis.

单个活体细胞是生命的基本单元与进化单位。因此单细胞功能基因组技术能够以空前的深度、灵敏度和通量来探索和突破“生命体系的异质性机制”与“尚不可培养微生物”等共性问题或瓶颈。项目组前期研制的“单细胞拉曼分选仪”已实现不需标记、基于生化表型的单细胞分选。针对分选出的单细胞，本项目研制的“单细胞遗传分析仪”在微流芯片上集成核酸提取、扩增和测序样品制备等功能，耦合细胞分选和DNA测序，从而测定单细胞16S/18S、基因组和转录组，允许同时从表观型和基因型来高通量地考察和验证单个细胞（及其群体）的功能。重点解决问题包括单细胞DNA/RNA的扩增策略、微量核酸扩增反应体系的表面吸附、细胞裂解、核酸提取、核酸扩增等的集成操作、单细胞反应体系优化、与上游细胞分选仪和下游测序仪的无缝对接等。本仪器将现代组学分析手段深化与拓展到单细胞层面，且对原核与真核细胞均适用，因此将解决单细胞分析中一个关键的共性瓶颈。

单细胞组学分析是生命科学方法学的热点与前沿，其中涉及单细胞分离获取、裂解、扩增、测序等诸多环节。三代测序技术的出现使基因组测序更加准确、快捷和便宜，然而单细胞核酸的样品制备一直是制约微生物单细胞基因组测序分析的瓶颈问题。本项目研发的基于微液滴的单细胞功能基因组集成化分析体系，能够将单细胞基因组样品制备的诸多环节集成在一起，不仅实现高通量、高可信度的分离获取单细胞，而且通过功能的集成化来减少样品在转移中的损失和降低来自环境和人为操作带来的污染。按照研究目标，本项目研制的“单细胞遗传分析仪”(SGA)已经具备耦合上游微生物单细胞拉曼分选（RACS）与下游单细胞基因组分析的能力。具体来说，SGA利用微流流控技术，集成了单细胞分选、单细胞裂解、核酸提取、扩增等功能模块，其性能通过酵母细胞等微生物细胞进行了验证。单细胞中心前期提出，基于单细胞拉曼成像的拉曼组（Ramanome）技术能够非标记、非破坏性地识别与分析几近无限的细胞功能。这一相当于“上游”的单细胞拉曼成像装备，与“中游”的单细胞拉曼分选装备和“下游”即本项目着重开发的单细胞核酸制备装备串联耦合，将能够针对任何细胞体系（不再受到是否有已知生物标示物、细胞能否标记等限制），从单个细胞精度的表观型和基因型来考察和验证微生物细胞群体或群落的身份和功能，从而在单个细胞精度建立生命体系表型和基因型的关联，因此具有重要的理论意义和实际用途。本项目的完成从原创仪器的角度打通了“单细胞拉曼成像-分选-测序”的上中下游全流程，为进一步研制全流程一体化仪器系统奠定良好的装备与技术基础。