单细胞尺度的嗜热细菌微进化研究

A single cell is the origin and a basic unit of evolution for cellular lives, therefore fundamental understanding of microevolution necessitates tracing trait origin and development at single-cell resolution. However most previous microbial evolution studies measured traits at the ‘clonal population’ resolution, thus suffering from two key limitations: (i) the bias in observed genotypic changes, and (ii) the omission of phenotypic differences among individual cells. In this proposal, the development of ethanol tolerance in the extremophile Thermoanaerobacter ethnolicus will be employed as a microevolution research model. We will combine single-cell Raman sorting and single-cell functional genomics techniques to simultaneously trace the genetic mutations and phenotypic changes at both clonal-population resolution and single-cell resolution. By circumventing the two key limitations, this strategy will enable thorough cataloging and tracing of the neutral, beneficial and harmful mutations, and allow interrogating contribution of the heterogeneity among individual cells to the functioning and evolution of cellular population. This study will unravel the interactions and co-evolution among the traits of ethanol tolerance, pentose/hexose co-utilization and ethanol production at both genetic loci, genome-wide gene-expression network levels, for individual cells and cellular populations. Consequentially the first single-cell resolution microevolution model for extremophiles will be established and the genetic foundation underlying microbial adaptation to a ‘new environment’ will be elucidated.

单个细胞是生物进化的起点和基本单位，因此只有在“单细胞尺度”观察、监测与追溯性状的发生与发展，才能从根本上认识微进化。但当前微生物微进化研究大多停留于“种群尺度”，故具“遗传突变测量的片面性”和“表型变异测量的平均化”等两个核心缺陷。本项目以嗜热厌氧乙醇杆菌乙醇耐受性的微进化为研究模型，通过单细胞拉曼分选与单细胞功能基因组技术的结合，同时监测细胞种群尺度及单细胞个体尺度的突变率与表型变化，从而克服上述两个核心缺陷，而能较全面地考察中性、有益及有害突变等的发生、分布和演化规律，深入探讨细胞个体间的异质性对细胞群体功能与微进化的贡献。本研究将揭示乙醇耐受性与两个相联系表型（戊糖己糖共利用、乙醇合成）在遗传位点、全基因组调控网络等不同层面和单个活体细胞、单一物种种群等不同尺度的共进化规律与互作原理，从而建立极端微生物的首个单细胞尺度的微进化研究模型，阐明极端微生物在“新环境”下微进化的遗传基础。

单个细胞是生物进化的起点和基本单位，因此在“单细胞精度”考察表型及其相对应的基因型，能从根本上剖析微进化过程。因此本项目核心目标在于建立以单个微生物细胞为单位的非标记式的表型识别、分选和基因组分析方法学，为单个细胞精度的微生物微进化研究提供一个新思路与新技术体系。. 目前，在方法学开发方面，项目组在细胞表型识别、细胞分选和基因组分析这三个关键环节均作出了技术示范，包括：（1）提出了拉曼组的概念，在非标记式、不需生物标识物的情况下，能定量表征与测定单个微生物细胞的甘油三酯含量、淀粉含量、分辨环境刺激物、药物敏感性、物种间代谢互作等一系列表型。（2）发明了与拉曼测量相耦合的单细胞弹射分选方法以及基于介电迟滞的单细胞拉曼流式分选方法，克服了荧光细胞分选(FACS)的主要局限和缺点。（3）发明了一系列基于微液滴技术的单细胞精准操作方法，证明能够基于微液滴快速简易地完成微生物单细胞分离与基因组测序的对接。. 在微进化模型构建方面，项目组以梭菌和微藻为模式体系，建立了细胞种群尺度的基因组进化及基因调控网络模型。（1）揭示了嗜热梭菌乙醇耐受性形成的过程特征和机制；（2）发现解纤维梭菌纤维小体的化学计量比例是由基因间DNA序列通过颈环结构的折叠能量精确编码的，提出此类非编码序列是纤维素降解能力进化的重要驱动力；（3）以微拟球藻为模式，揭示了产油途径的遗传和进化规律，并构建了首个微藻产油全基因组分子过程模型。这些工作为正努力中的“单细胞尺度”微进化研究提供了细胞群体层面的实验体系与参照。. 本项目已经发表论文9篇（标注项目编号），分别发表于Nature Communications、PLoS Genetics、Biotech Biofuels、Anal Chem、Scientific Reports等，培养博士生4名与硕士生1名。