Bt杀虫蛋白受体的功能鉴定及受体片段增效作用研究

对Bt抗性机制的认识不足，正严重制约着Bt抗药性的治理和新型Bt杀虫蛋白的开发与应用。.本项目拟克隆Bt抗性和敏感小菜蛾ABC转运蛋白基因，根据已克隆的钙粘蛋白、氨基肽酶、碱性磷酸酶和糖脂类4种可能Bt受体基因全长，利用荧光定量PCR技术确定5种受体基因在小菜蛾体内不同龄期的表达水平；筛选各基因有效的dsRNA基因片段，建立针对5种受体基因单一及两两沉默的RNA干扰体系；测定两小菜蛾品系受体基因单一及两两沉默后对Bt的反应特性，明确起主导作用的受体。将筛选的各基因有效片段进行表达、纯化，测定该片段对Bt类毒素毒性的影响，筛选作为增效剂的片段。实验结果将从功能基因的沉默方面直接明确小菜蛾Bt受体基因的种类及起主导作用的受体，有助于阐明小菜蛾对Bt的抗性分子机制；筛选作为Bt增效剂的基因片段，扩大Bt对重要农业害虫鳞翅目害虫的杀虫谱。研究结果对新型Bt的开发与可持持续应用均有理论和实践意义。

昆虫中肠钙粘蛋白（Cadherin）、氨肽酶氮（Aminopeptidase N）及碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase）为苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis，Bt）杀虫晶体蛋白受体中的三个受体。它们能够促进毒素单体的寡聚化，形成毒素寡聚体后诱导毒素分子的空间构象发生变化，介导毒素寡聚体与各受体之间的特异性结合。已有报道棉铃虫（Helicoverpa armigera）和烟草天蛾（Manduca sexta）等的钙粘蛋白、氨肽酶氮及碱性磷酸酶的毒素结合区片段等能增强或抑制杀虫晶体蛋白Cry1对靶标昆虫的活性。.本研究利用RNAi技术对沉默了小菜蛾中肠cadherin基因进行沉默处理，明确了cadherin基因沉默对小菜蛾对Cry1Ac毒素敏感性的影响。结果表明，注射目标dsRNA后的第1天至第5天均能显著减少Cry1Ac敏感及抗性小菜蛾品系cadherin的基因表达量，尤以第2天的减少量最为最多明显；Cry1Ac毒力测定结果表明，沉默cadherin基因能在一定程度上提高幼虫的成活率，即可使小菜蛾对Cry1Ac毒素的敏感性降低。初步研究初步表明，cadherin基因的功能与小菜蛾对Cry1Ac毒素的抗性有关。.本研究根据已报道的昆虫毒素结合区钙粘蛋白、氨基肽酶氮及碱性磷酸酶片段对Cry1Ac有增效或抑制作用，以3龄小菜蛾幼虫为研究对象，选取其钙粘蛋白、氨基肽酶氮及碱性磷酸酶片段相同功能区的五个受体片段，将其进行克隆。通过pGEX-6P-1载体，在大肠杆菌中超量表达了五个功能区片段：钙粘蛋白片段PxCAD-1， PxCAD-2， PxCAD-3，氨肽酶氮片段PxAPN1及碱性磷酸酶片段PxALP。.使用致死中浓度剂量的CrylAc及中高浓度的PxCAD1、PxAPN1、PxALP、PxCAD2与PxCAD3片段对小菜蛾幼虫进行体外复配生测，1.87μg/mL的Cry1Ac可引起小菜蛾三龄幼虫46.7%的死亡率，当加入终浓度为551.25 μg/mL的GST-PxCAD2时，其死亡率为45%；当加入终浓度为204.67 μg/mL的GST-PxCAD3时，其死亡率为48.9%，当加入终浓度为187.33 μg/mL的GST-PxAPN1时，其死亡率为45.6%；而对照组加入终浓度为300.27μg/mL的pGEX-6p-1时，小