小麦TaLr19TLP1基因抗叶锈病功能鉴定及互作蛋白的筛选

Leaf rust, caused by Puccinia triticina, is one of the most destructive diseases of common wheat all over the world, and its epidemic commonly causes both yield losses and production with lower quality. Both genetic improvement and research on the resistance mechanism of wheat to Puccinia triticina are always important scientific problems in breeding and genetics. We have firstly cloned a thaumatin-like proteins (TLPs) gene named TaLr19TLP1 from wheat near-isogenic lines TcLr19 infected by leaf rust, which may take part in resistance of wheat to Puccinia triticina, and is a potentially resistance factor. In order to character and study on the molecular mechanism of TaLr19TLP1 involved in resistance of wheat to Puccinia triticina, in this project the research is as following: First, the real time quantitative PCR and Western blotting will be used to analyze expression characteristics in gene and protein level of TaLr19TLP1 both in incompatible and compatible interactions respectively; Secondly, the resistance of TaLr19TLP1 to Puccinia triticina will be charactered by genetic transformation by gene gun transformation; Thirdly, we will capture TaLr19TLP1 – interacting proteins using yeast two-hybrid system and screen important factor mediated resistance of TaLr19TLP1 in wheat proteome, and analyzed the value of protein interaction in resistance of wheat to Puccinia triticina. These results will not only provide reliable evidences for research on resistance mechanism of wheat to Puccinia triticina, but also have important theoretical and practical significance in molecular breeding for wheat resistance.

小麦叶锈病是威胁世界小麦稳产高产的主要因素之一。抗病品种的选育和抗病机制的研究一直是小麦遗传育种领域重大的科学问题。项目组首次在TcLr19小麦中克隆获得了一个类甜蛋白基因，TaLr19TLP1，其表达受小麦叶锈菌诱导，可能在小麦抗叶锈病防御反应中发挥作用。为明确该基因抗叶锈病功能与分子机制，本项目拟进行以下研究：1、利用qPCR和Western杂交技术检测TaLr19TLP1在亲和组合和非亲和组合中的表达情况；2、利用基因枪介导法转化目的基因，明确TaLr19TLP1基因抗叶锈病功能；3、利用酵母双杂交技术从小麦蛋白组中捕获TaLr19TLP1互作蛋白，筛选介导其抗病反应的重要因子，并分析蛋白互作的抗病意义。此项研究将首次在国内外对叶锈菌诱导下小麦类甜蛋白进行研究，研究结果将不但为深入研究类甜蛋白参与小麦与叶锈菌相互作用的分子机理奠定基础，而且对小麦抗病分子育种具有重要的理论和应用价值。

小麦叶锈病是威胁世界小麦稳产高产的主要因素之一。小麦叶锈病造成的危害虽然没有秆锈病和条锈病严重，但因其发生频率高、范围广，年损失比条锈病和秆锈病还重。随着全球性气候变暖，未来的温度和湿度条件可能会更加适合小麦叶锈病的发生和流行。抗病品种的选育和抗病机制的研究一直是小麦遗传育种领域重大的科学问题。小麦作为六倍体，基因组庞大、复杂，且重复序列多；叶锈菌专性寄生，且具有双核结构，这些都制约着小麦抗叶锈病分子机制研究的进展。该项目原计划解析类甜蛋白在小麦中的表达情况及其参与小麦与叶锈菌相互作用的分子机理。项目进展顺利，超额完成任务。项目组首次在优良小麦抗叶锈病材料TcLr19中克隆获得了一个类甜蛋白基因，TaTLP1，利用qPCR和Western杂交技术分别从RNA和蛋白水平上分析了TaTLP1在叶锈菌与小麦亲和组合和非亲和组合中的表达情况，明确其表达受小麦叶锈菌和水杨酸（SA）诱导，同时验证了该基因在小麦不同生长发育时期的表达情况；明确了该基因在六倍体小麦中存在3个拷贝，分别位于7A，7B和7D。成功构建了TaTLP1转基因超表达载体，并利用农杆菌介导法侵染小麦幼胚，完成组织培养和植株再生，最终获得6个T0代转基因阳性株系。在温室完成加代，获得多个转基因后代，通过接菌鉴定、PCR扩增验证了转基因植株的真实性，并通过qPCR验证、组织病理学观察和多种病程相关基因和酶的测定，明确了TaTLP1基因抗叶锈病功能，证明了TaTLP1基因参与小麦抗叶锈病防御反应；利用酵母双杂交和GFP Trap技术从小麦蛋白组中捕获TaTLP1互作蛋白，明确了可能与TaTLP1互作的蛋白种类；利用BiFC、CoIP和共定位等技术重点验证了TaTLP1和TaPR1的互作，分析了蛋白互作的关键位点，明确TaTLP1与TaPR1的互作主要取决于C端的半胱氨酸。项目首次在国内外对叶锈菌诱导下小麦类甜蛋白基因进行研究，研究结果不但为深入研究类甜蛋白参与小麦与叶锈菌相互作用的分子机理奠定基础，而且对小麦抗病分子育种具有重要的理论和应用价值。