区域捕获重测序与单类细胞转录组结合精细定位猪CD4+/CD8+比值性状的主效基因

The ratio of T lymphocyte CD4+/CD8+ is one of the important indicators for the immunity of individuals. However, the major genes and molecular mechanism of the CD4+/CD8+ T lymphocyte ratio in pigs remain unknown. A GWAS analysis had been applied for the quantitative traits of T lymphocyte subsets in F2 resource population on Duroc × Erhualian by the applicant. The results revealed that thirty-nine SNPs in a region(61.9-69.89Mb) on chromosome 5, showed most significantly association with the ratio of CD4+/CD8+ in genome-wide level. On the basis of previous research, the applicant will perform further post-GWAS study combining target region resequencing and single type cell RNA-Seq analysis of single CD4+ and CD8+ cells. The project will fine map major genes and QTNs for the ratio of CD4+/CD8+ and construct gene regulatory networks through analyzing the haplotype map, selective sweeping and single cell level of exact expression pattern, and then validate the regulatory function of targeted gene and QTN at population and cellular levels. The aim of the project is to clarify preliminarily the regulation mechanism that cause trait variation of T lymphocytes CD4+/CD8+ ratio. The results will shed light on understanding of the molecular genetic basis of the ratio of CD4+ /CD8+ in mammalian and promot the study of porcine breeding for disease resistance.

T淋巴细胞亚群CD4+/CD8+比值是衡量机体免疫力的重要指标之一，但目前对调控猪T淋巴细胞CD4+/CD8+比值变异的主效基因及调控机制仍不清楚。申请人在杜洛克×二花脸F2资源群体中对T淋巴细胞CD4+/CD8+比值性状进行全基因组关联分析的前期研究中发现，在5号染色体的61.9-69.89Mb区间内有39个与显著关联的SNP位点。本项目拟在此基础上进一步开展后GWAS（post-GWAS）研究，利用基于GWAS结果的区域捕获重测序、CD4+和CD8+单类细胞高精度转录组数据的联合研究策略，通过单倍型图谱、选择性清扫与单细胞水平的精细表达模式等分析，精细定位目标区域内的主效基因及QTN，并构建相关调控网络，同时从群体和细胞水平进一步验证目标基因及QTN的调控功能。本项目预期成果对于深入理解哺乳动物T淋巴细胞CD4+/CD8+比值的分子遗传基础及推进猪抗病育种研究均有重要的科学和实践意义。

CD4+T细胞是一类重要的免疫细胞，在机体抵抗细菌及病毒感染方面发挥着重要作用。本项目利用生物信息学和免疫组学技术克隆并鉴定与猪的CD4+相关的分子机制。通过全基因组关联分析（Genome-wide association analysis ，GWAS）鉴定与CD4+相关的SNP，并对显著性SNP位点进行全基因组单倍型分析，共鉴定了1296个显著性SNP，这些SNP主要分布在5号染色体上，全基因组单倍型分析发现CD4 基因位于最显著的一个单倍型 Block 中，最显著Block 有两种单倍型。为了进一步验证这两种单倍型对CD4+的影响，我们运用单克隆测序和免疫荧光分析的方法，从个体水平和细胞水平揭示CD4 基因在两单倍型之间的差异，鉴定影响CD4膜蛋白正常表达的关键突变位点。共鉴定了5种选择性剪切方式，分别为 CD4fl（全长 CDS）、CD4Δ4（第 4 外显子缺失）、CD4Δ8（第 8 外显子缺失）、CD4Δ4Δ8（第 4、8 外显子同时缺失）、CD4Δ4’Δ5’Δ8（第 4外显子与第5外显子均部分缺失，第8外显子完全缺失），其中第4外显子的缺失、第4、8外显子同时缺失目前只在本室杜洛克×二花脸 F2 代群体中发现。两单倍型在个体水平的选择性剪切存在差异，A单倍型选择性剪切方式比B单倍型多，并且第4外显子的缺失只在A单倍型中存在，第8外显子缺失、第4、8外显子同时缺失比例在A单倍型中比B单倍型中高。两单倍型个体之间存在差异表达基因，主要是TNF、CXCL2、CD14、IL18、IL1β1等调节Toll样受体信号通路、NF-κB 信号通路等免疫重要通路的基因。两单倍型的膜蛋白表达在细胞水平存在差异，A单倍型膜蛋白在24h正常表达，在48h出现膜蛋白崩解的现象，而B单倍型在两个时间点都正常表达，影响 CD4 膜蛋白正常表达的关键突变位点主要集中在CD4-Ig-like的D1区，该区主要是CD4分子与MHCII类分子结合的区域。两单倍型与CD4流式抗体的结合能力存在差异，A单倍型不能和抗体结合，而B单倍型能与抗体结合。说明猪 CD4 基因的两种单倍型之间存在差异，这种差异可能是不同猪种之间免疫差异的遗传背景之一，这将为抗病育种提供理论依据。