小麦低温响应蛋白PAP6-like互作蛋白筛选及功能分析

Cold stress especially spring frost is one of the major abiotic stresses that effects wheat yield, and also an important factor causing wheat yield reductions in China. One key cold tolerant gene PAP6-like was identified using a recombinant inbred line (RIL) population and proteomics technique in our previous study. Virus-induced gene silencing (VIGS) and tetraploid wheat ethyl methane sulfonate (EMS) mutant indicate that this gene plays a vital role in conferring cold including spring frost tolerance in wheat. On this basis, this research plans to utilize PAP6-like as bait to screen the interactive proteins in built wheat yeast library using yeast two-hybrid system (Y2H). Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) and co-immunoprecipitation (Co-IP) will be used to further validate the protein interaction between key candidate proteins and PAP6-like. The responsive function of one key candidate gene involved in cold including spring frost stress will be verified by VIGS, wheat EMS mutants, CRISPR/Cas9 technology and transgenic wheat with overexpression. This study will not only provide valuable genetic resources for wheat resistant breeding in China, but also be helpful to the further research of the genetic basis and regulatory mechanism for wheat cold response.

低温尤其是倒春寒是影响小麦产量的主要非生物胁迫因子之一，近年来造成我国小麦严重减产。申请人前期利用一个小麦重组近交系群体和蛋白组学技术，发现了一个耐寒性关键基因PAP6-like；病毒诱导基因沉默（VIGS）和EMS突变体结果表明，该基因在增强小麦低温包括倒春寒抗性方面发挥重要作用。在此基础上，本研究以PAP6-like蛋白为诱饵，利用酵母双杂技术对已构建的小麦酵母双杂文库进行互作蛋白筛选，进一步通过双分子荧光互补和免疫共沉淀技术对关键候选蛋白与PAP6-like的互作关系进行验证；并利用VIGS技术、小麦EMS突变体、CRISPR/Cas9技术以及超表达转基因小麦对其中1个关键候选基因的低温抗性包括倒春寒响应功能进行验证。本研究能够为我国小麦抗逆育种提供重要基因资源，同时也将有助于进一步解析小麦低温响应的遗传基础和调控机理。

低温尤其是倒春寒是影响小麦产量的主要非生物胁迫因子之一，近年来造成我国小麦严重减产。申请人前期利用一个小麦重组近交系群体和蛋白组学技术，发现了一个耐寒性关键基因PAP6-like (TaPAP6L)；病毒诱导基因沉默（VIGS）和EMS突变体结果表明，该基因在增强小麦低温包括倒春寒抗性方面发挥重要作用。在此基础上，本研究以TaPAP6L蛋白为诱饵，利用酵母双杂技术对已构建的小麦酵母双杂文库进行互作蛋白筛选。鉴定到一个与TaPAP6L存在强相互作用的蛋白TaSnRK1α。通过过表达、EMS和CRISPER/ cas9介导的突变系进一步证实TaSnRK1α正向调控小麦低温抗性。内源激素检测表明，TaSnRK1α过表达和突变株系茉莉酸 (jasmonic acid, JA)发生了显著变化。外源JA显著提高显著提高小麦植株的耐寒性。为了解析TaSnRK1α参与JA的机制，进行了体内体外磷酸化实验，结果表明TaSnRK1α通过磷酸化促进TaPAP6L蛋白水平的提高。过表达和EMS突变系证实TaPAP6L正向调节耐寒性。转录组测序结果显示，TaPAP6L过表达系显著提高了JA含量，可能是通过促进JA合成的前体α-亚麻酸和抑制JAR1降解JA。综上所述，TaSnRK1α通过磷酸化TaPAP6L提高小麦植株内源JA含量进而增强小麦低温抗性。本研究能够为我国小麦抗逆育种提供重要基因资源，同时也将有助于进一步解析小麦低温响应的遗传基础和调控机理。