新疆冷水鱼抗冻蛋白的结构特性及抗冻机理的研究

Antifreeze protein (AFP), with the thermal hysteresis activity, can change the growth and inhibit the recrystallization of the ice, and which can be used as an effective antifreeze additive used in food freezing, storage, transport and thawing process in order to maintain food quality. Xinjiang has the unique climate characteristics, and the species of cold water fish are up to more than 20 species. However, up to now, scientists have paid little attention to AFP of Xinjiang cold water fish. Therefore, AFP of Xinjiang cold water fish will be extracted, separated and purified by the specific affinity purification method at this thesis. The structural characteristics and physicochemical properties of AFP will be studied by use of traditional structural characterization method (such as MALDI-TOF-MS, LC-MS/MS, N-terminal sequence analysis) combined with modern bioinformatics technology. On this basis, the antifreeze mechanism of AFP will be analyzed with molecular mechanics and semi-empirical quantum mechanics AM1 and PM3 methods, at the same time, the different hydrophilicity and hydrophobicity of site-directed mutants of antifreeze proteins will be designed, and the antifreeze activity change rule of that will be analyzed. Eventually, the antifreeze mechanism of antifreeze protein of Xinjiang cold water fish will be revealed with combined the related theoretical model. This study will provide technical support with the purpose of comprehensive utilization of antifreeze protein of Xinjiang cold water fish in the future, and provide on theoretical data for the study of the structure characteristic, antifreeze mechanism and evolutionary analysis of antifreeze protein.

抗冻蛋白是一类具有热滞活性、能改变冰晶生长形态和抑制冰晶重结晶的蛋白质，可作为一种有效的抗冻添加剂应用于食品的冷冻、储藏、运输和解冻过程以保持食品质量。新疆具有独特的气候特征，冷水鱼品种多达20余种，而目前国内外对其中的抗冻蛋白研究开发未引起足够重视。因此本课题将采用特异性亲和法分离纯化新疆冷水鱼中的抗冻蛋白，并通过传统的结构表征方法结合现代生物信息学方法阐明其结构特征和理化性质；在此基础上，采用分子模拟技术，即利用分子力学和半经验量子力学AM1和PM3方法对新疆冷水鱼中抗冻蛋白与冰晶面结合的相互作用进行分析研究，同时设计不同亲水、疏水性的定点突变体抗冻蛋白，分析其抗冻活性变化规律，最后结合相关的理论模型揭示新疆冷水鱼中抗冻蛋白的抗冻机理。本研究将为今后综合利用新疆冷水鱼抗冻蛋白奠定了坚实的技术支撑，同时为鱼类抗冻蛋白在结构特性、抗冻机理和进化分析方面的研究提供了理论数据。

抗冻蛋白具有结合到冰晶表面，抑制冰晶生长、降低冰点和抑制重结晶作用，因此可作为一种有效的抗冻添加剂应用于食品的冷冻、储藏、运输和解冻过程以保持食品质量。本课题以新疆冷水鱼为原料，发现白斑狗鱼鱼皮和鱼肉中存在AFP，对其抗冻蛋白进行了分离纯化及结构表征，同时对其进行了生物信息学及抗冻机理分析。本课题以胡萝卜抗冻蛋白为研究对象，应用差示扫描量热法（DSC）研究其抗冻活性，对可能影响到其抗冻活性的因素，如稳定性、重复性和精密度做了全面的考察。结果表明，DSC测定的热滞活性具有较高的稳定性、重复性和精密度。以白斑狗鱼为研究对象，选取鱼皮和鱼肉组织为试验材料，以抗冻蛋白的热滞活性作为考察指标，通过单因素及响应面试验对鱼皮和鱼肉中的抗冻蛋白提取工艺条件进行优化，结果表明，鱼皮中抗冻蛋白的提取最优条件为：提取温度8℃、提取液pH值为8.4、提取时间2h、料液比1:3.8（g/mL）；鱼肉中抗冻蛋白的提取最优条件为：提取温度5.14℃、提取液pH值为8.4、提取时间1.88h、料液比1:2（g/mL）。通过阴离子交换柱和分子筛层析柱纯化后获得了电泳纯的抗冻蛋白，经过HPLC、质谱分析，鱼皮（ElsAFP）和鱼肉（ElmAFP）中抗冻蛋白纯度都较高，其相对分子质量分别约为6.3 ku和7.4 ku，并分别对其时行了N-末端氨基酸及全序列的测定。生物信息学分析显示：ElsAFP的氨基酸残基数为56，分子量约为6000.3 u，理论等电点为7.98，具有较强的疏水性，且有信号肽存在，剪切位点位于第16位和第17位氨基酸之间，具有从膜内到膜外的方向上偏好性很强跨膜螺旋区，该区域位于第1-18位氨基酸，二级结构预测分析显示，α螺旋、β折叠和无规则卷曲的氨基酸比例分别为15.68%、36.04%和48.28%，预测准确度为73.60%；ElmAFP的氨基酸残基数为58，分子量约为6174.5 u，理论等电点为6.14，具有较强的疏水性，无信号肽存在，不存在跨膜结构，二级结构预测分析显示，α螺旋、β折叠和无规则卷曲的氨基酸比例分别为20.69%、12.07%和62.06%，预测准确度为66.62%。抗冻机理分析显示：ElsAFP和ElmAFP相似度较高的同源蛋白分别为1ops.1.A和4ur6.1.A，并以其为模板构建模型，采用分子模拟技术，利用分子力学和半经验量子力学AM1和PM3方法对抗冻蛋