Vinculin 在斑马鱼心脏发育中的功能以及其突变体作为扩张性心肌病模型的研究

In recent years, zebrafish (Danio rerio) has been shown to be a very useful model system to study heart development. Analysis of zebrafish mutants have shed new light to fundamental processes of heart development. Some results of the studies also have strong implications to human heart development and related diseases. We have used Tol2 transposon-mediated gene trap approach to identify critical genes involved in embryonic patterning and organ morphogenesis. In this ongoing screen, we obtained an EGFP insertion mutant V12, which encodes a predicted polypeptide with high homology to human vinculin. The homozygotes of V12 show multiple cardiac defects and die at larva stage. Vinculin is an important cytoskeleton protein for cell-cell and cell-matrix adhesions. V12 mutant fish shows marked heart morphology changes, including expanded atrium and ventricle, thickened epicardium and enlarged valves. These phenotypes share similarity to dilated cardiomyopathy (DCM). In V12 mutants, early cardiac maker cmlc2 and nkx2.5 is not affected but the looping of heart tube is changed at 77 hpf, suggesting VCLa gene is not involved in cardiac progenitor specification, but in heart morphogenesis and maintenance. Furthermore, the epicardium cells of the mutant change from squamous epithelial cells to cuboidal shape cells and the endocardium cells has impaired attachement to muscle fibers.Our recent result indicate YAP expression is strongly upregulated in epicardium layers， suggesting Hippo or related pathways may mediate VCLa functions during heart development.Taken together, our current results strongly suggest that VCLa plays essential roles in zebrafish heart development and homeostasis and the mutant fish may serve as a good model to study the mechanisms of human DCM. We believe we are in a unique position using this EGFP trapped mutant to address the following questions: 1) What functions does VCLa exert in cellular changes during heartmorphogenesis? 2) How signaling pathways downstream of VCLa regulate heart morphogenesis? 3) Are null mutants of the VCLa paralog VCL also involved in heart development? Are there any biochemical redundancy between VCLa and VCL? 4) Whether human Vinculin gene can rescue VCLa mutant phenotypes? We expect our results will extend understanding of cellular mechanisms of zebrafish heart morphogenesis and will help establish the V12 mutant as a useful model to study DCM in human.

我们获得了一个V12斑马鱼突变体，其突变基因编码蛋白VCLa 与人Vincilin蛋白质具有高同源性。 Vinculin 在细胞与细胞以及细胞与细胞外基质链接中起重要作用。斑马鱼V12突变体心脏显示心房和心室均有扩张，心外膜细胞层增厚和瓣膜扩张，与人心肌扩张病表型类似。此外，心外细胞层YAP蛋白质显著上调，提示Hippo或者相关信号转导通路介导了VCLa的功能。 本申请计划研究：1) VCLa 如何在心脏形态建成中的功能是什么？ 2)VCLa下游信号通路如何调节心脏形态建成？ 3）VCLa 旁同源基因（paralog）VCL是否也参与心脏发育，它是否与VCLa存在冗余功能？ 4）人Vinculin基因是否可以挽救V12突变体表型？ 我们认为这些研究将有助于深入了解心脏发育形态建成的细胞生物学机制，同时也可能把V12突变体建立为人心肌扩张病的一个重要模型。

冠状血管功能异常是心脏病的主要类型。 心外皮细胞在心脏冠状血管发育中起着重要的功能， 然而因为成像技术的限制， 研究哺乳类动物冠状血管发育受到限制。 本项目通过在斑马鱼中获得的一个Vinculin-GFP基因捕获鱼系，采用成像技术以及细胞生物学以及生物化学方法详细研究了Vinculin 在细胞外基质在细胞信号转导中的作用机制。 根据项目计划书内容， 本项目主要在以下几个方面开展工作。 1）通过基因捕获技术发现了Vinculin-GFP 在斑马鱼表达谱； 2）研究了GFP－vinculin 在心外皮细胞中的功能， 包括新外皮细胞在血管形成中的调控机制，另外也探讨了心肌细胞再生方面的可能功能。2）vinculin在细胞外基质向胞内传导信号， 尤其是机械力信号的研究。..本项目的重要结果如下：..1） 研究了vinculin 突变体心肌细胞损伤以及vinculin信号通路在心肌再生过程可能的作用。通过一系列生物化学和细胞生物学研究， 包括细胞示踪技术以及自由基检测等， 发现斑马鱼vinculin缺失突变体心肌细胞再生很可能出现增殖障碍，也可能在除了冠状血管之外，加重了突变体的表型 ，在另外一个层面导致心脏功能衰竭。 结合人vinculin突变，这些进一步的发现有助于加深人心肌肥大病的研究病因学研究。..2）此前的研究表明分子机制研究方面， Vclb 缺失突变体心肌细胞相对正常， 很可能是由于心肌细胞中 表达Vclb类似蛋白Vcla的补偿效应造成的。 当Vcla被部分抑制后， 可观察到心肌细胞发育异常， 进一步证实了此前的推测。 下一步的研究计划是扩展Vclb， Vcla双突变在心脏心外膜细胞，心肌细胞的双重作用， 尤其是在机械力传导方面的代偿机制研究， 以及在心脏再生方面的作用等。..总之，本项目按照计划书的研究内容安排， 完成了研究目标， 在主流期刊发表了相关成果。 相关结果对于先天性心脏病发病了解有一定的指导意义。