靶向肿瘤的pH响应性葡聚糖-多肽卷曲螺旋纳米凝胶用于蛋白类药物的高效细胞内释放

Novel tumor-targeting, pH-responsive dextran-peptide coiled coil nanogels were designed for intracellular release of protein drugs. After the modification of dextran with E3 and K3 peptides, respectively, dextran-peptide nanogels could be prepared using nanoprecipitation owing to the complementary coiled coil structure of E3 and K3 peptides in neutral pH condition. The main advantages of this novel dextran-peptide nanogel system are as follows: (1) The controlled protein release in endosome by making use of the pH responsiveness of E3/K3 coiled coil structure (stable at pH 7.0, but unstable at pH 5.0); (2) the loading of hydrophilic protein drugs (Cytochrome C, Granzyme B) into dextran-peptide nanogels by the mild, facile nanoprecipitation method; (3) the enhanced anti-tumor efficacy of protein drug-loaded nanogels for αvβ3 receptor positive tumors (glioma, melanoma, neovasculature) by modifying dextran-peptide nanogels with active targeting ligand (cRGD peptide). By combining the active targeting of RGD peptide and pH responsiveness of E3/K3 peptides, the dextran-peptide nanogels can achieve better anti-tumor efficacy with lower systemic toxicity.

本项目利用E3和K3多肽间互补卷曲螺旋结构的pH敏感性，通过纳米沉淀法构建新型肿瘤靶向、pH敏感的葡聚糖多肽卷曲螺旋纳米凝胶，用于蛋白类药物细胞内控制释放。本项目设计的多功能纳米凝胶具有如下特点：（1）通过E3和K3多肽互补卷曲螺旋结构的pH敏感性（在pH7.0稳定，而在pH5.0时解离），实现蛋白药物细胞内涵体释放；（2）E3和K3多肽在内涵体中解螺旋后，进一步和内涵体膜融合，促进蛋白药物（Cytochrome C 或 Granzyme B）逃离内涵体，更好的诱导细胞凋亡；（3）载药纳米凝胶经cRGD肽修饰后，能够实现蛋白药物对整合素αvβ3受体表达阳性的恶性肿瘤组织及肿瘤新生血管的靶向输送。本项目通过结合E3和K3多肽卷曲螺旋pH响应性和cRGD肽的分子靶向，最终实现对恶性肿瘤高效低毒的治疗目标。

细胞内作用的蛋白类抗癌药物的临床转化因缺乏安全有效的递送载体而受到极大地限制。本项目利用E3和K3多肽间互补卷曲螺旋结构的pH敏感性，通过纳米沉淀法构建新型肿瘤靶向、pH敏感的透明质酸（HA）多肽卷曲螺旋纳米凝胶，用于蛋白类药物细胞内控制释放。主要研究结果如下：（1）以生物大分子HA为骨架材料，通过氨基/马来酰亚胺异双功能交联剂分别将卷曲螺旋多肽E3和K3键合到HA主链，制备得到HA-E3和HA-K3，并通过纳米沉淀法顺利得到HA-cNGs卷曲螺旋纳米凝胶；（2）通过优化纳米凝胶的形成条件，得到具有合适尺寸（176 nm）和形貌的纳米凝胶，且该纳米凝胶可在生理条件下高度稳定，而在模拟内涵体微酸环境下（pH 5.0）快速响应；（3）通过电荷相互作用实现对模型蛋白（细胞色素C,CC）和治疗性蛋白（Saporin，SAP）高效包载，并在模拟内涵体条件下实现对所包载蛋白的pH敏感控制释放；（4）HA-cNGs可在癌细胞表面CD44受体的介导作用下，高效靶向进入MCF-7人乳腺癌细胞，且进入胞内的纳米凝胶量呈明显的时间依赖性，激光共聚焦显微照片显示HA-cNGs-CC可在胞内通过pH敏感响应顺利释放所载蛋白质；（5）载蛋白毒素SAP纳米凝胶（HA-cNGs-SAP）成功将SAP递送至CD44过表达的MCF-7及MDA-MB-231乳腺癌细胞质中，通过诱导凋亡高效杀死癌细胞（对MCF-7细胞的半数抑制浓度低至12.2 nM）。本项目研制的HA-cNGs-SAP制备工艺简单、可主动靶向肿瘤细胞并在胞内高效快速释放所载蛋白药物，在恶性肿瘤的蛋白药物靶向治疗方面展现出较好的前景。此外，我们在HA-cNGs研制的基础上，我们还尝试以壳聚糖为基材，设计合成了GC-cNGs,并将该纳米凝胶表面进行靶向配体cRGD修饰，可实现对αvβ3整合蛋白过表达的B16F10细胞和U87-MG细胞的主动靶向效果。