水稻耐冷新基因OsbZIP32的功能研究

Chilling injury is one of the most important limiting factors for rice yield and quality. Efficient and accurate breeding cold resistant rice varieties through rational breeding and/or genetic engineering strategies，are the keys to solve chilling injury. However, the tolerance of plants to chilling is a complex process and the mechanism is not clear, which affects its application in breeding. Therefore, it is of great theoretical significance and application value to excavate and study the mechanism of cold tolerance genes in rice. Previously, we used a large-scale Hybrid Transcription Factor (HTF) strategy to examine roles of different TFs in cold tolerance of rice and a new gene OsbZIP32 for cold tolerance was identified. Based on a previous research, the objectives of this proposal is 1) to identify and functional characterize the gene OsbZIP32 by phenotypic identification, physiological and biochemical analysis, transcriptional activity analysis, expression analysis, yeast two hybrid, interaction analysis, RNA-seq analysis etc; 2) to reveal the interaction of OsbZIP32 protein and other factors involved in cold tolerance of rice. The completion of this project will provide useful information to reveal the genetic mechanism for cold tolerance in rice，also greatly enrich the genetic basis of cold tolerance rice breeding.

低温冷害是水稻产量和品质的重要限制因子之一。通过合理的育种或基因工程手段高效和精确地培育耐冷水稻品种，是解决低温冷害的关键。但植物对低温的耐受性是一个系统的复杂的调控过程，机制还不清楚，这影响了其在育种中的应用。因此，进一步开展水稻耐冷机制研究，挖掘更多的水稻耐冷基因具有十分重要的理论意义和应用价值。OsbZIP32是通过大规模合成型转录因子筛选获得，是控制水稻耐冷新基因。本申请拟在原有研究的基础上，进一步研究OsbZIP32的功能。通过水稻各个时期的耐冷表型鉴定、生理生化指标分析、转录活性分析、表达分析、酵母双杂、互作分析、RNA-seq分析等对该基因的功能进行深入的研究，以期揭示OsbZIP32在水稻耐冷调控中的重要作用及与其它蛋白的上下游和互作关系，解析OsbZIP32的分子机理和网络调控。本项目的完成将为水稻耐冷调控机制的研究提供理论基础，同时极大的丰富耐冷水稻育种的遗传基础。

低温冷害是限制水稻生产及种植范围的重要因素之一，挖掘水稻耐冷基因，开展水稻耐冷机制研究，培育耐冷水稻品种对于确保高纬度地区的水稻高产稳产具有重要意义。本实验室前期通过对转录因子过量表达转基因水稻耐冷性筛选，获得一批和水稻耐冷相关的基因，包括OsbZIP32、OsWRKY63等。过表达OsbZIP32水稻材料的耐冷性显著低于背景材料Kitaake，而基因敲除突变体材料的耐冷性显著高于Kitaake，说明OsbZIP32是水稻耐冷的负调控因子。OsbZIP32定位在细胞核中，是一个转录激活子。OsbZIP32的表达受到低温、干旱等非生物胁迫和植物激素ABA的诱导。外源ABA处理的结果表明过表达OsbZIP32可显著提高水稻对ABA的敏感性。在正常和低温（4℃）处理24h条件下，对过表达植株和Kittake三叶期的幼苗进行转录组测序分析（RNA-seq），结果表明在正常条件下，Kitaake和过表达植株间存在80个差异基因；在冷处理条件下，Kitaake和过表达植株间存在61个差异基因。在这些差异基因中，我们筛选了3个表达差异较大，且表达量受低温诱导的基因，目前正在通过转基因明确其生物学功能。同时我们发现多个已报道的耐冷基因在过表达材料中的表达量显著低于Kitaake。另外，我们利用酵母双杂交筛库的方式鉴定OsbZIP32的互作蛋白，发现OsMPK9可与OsbZIP32互作。这些结果初步阐明了OsbZIP32调控水稻耐冷的分子机制。OsWRKY63同样是一个水稻耐冷的负调控因子。OsWRKY63可直接结合OsWRKY76和OsWRKY41的启动子并抑制其表达。OsWRKY76是已报道的水稻耐冷的正调控因子。进一步的研究表明OsWRKY76可与转录因子OsbHLH148互作。OsbHLH148被报道参与调控水稻体内JA的信号转导，而JA的实验结果表明OsWRKY63和OsWRKY76也参与调控水稻JA信号。这些结果阐明了一条新的依赖JA的水稻耐冷调控途径。除此之外，本项目还鉴定了另外2个低温胁迫相关和2个株型相关基因。这些基因的功能研究对解析水稻耐冷调控机制具有重要的科学意义，同时为培育耐冷水稻品种提供了理论基础和重要材料。