水稻耐冷性相关QTL, CTZFP8基因的克隆及功能研究

We have identified a cold resistance QTL, CTZFP8 gene, which is one of the new zinc-finger transcription factors in rice. Overexpression of CTZFP8 transgenic rice exhibited cold tolerance phenotype. In this project, using quantitative real-time PCR, we will analyze mRNA expression patterns of CTZFP8 in different tissues and various expression profiles during various stresses including cold, high salt, drought, and abscisic acid (ABA); by constructing CTZFP8 RNA interference and EAR deletion overexpressing transgenic rice，comparing with overexpression lines, elucidate the function of CTZFP8 under cold stress and its influence to rice growth ; using GFP transient expression assay and hitochemical GUS assay, investigate the intracellular localization and tissue specific expression patterns of CTZFP8;using yeast two hybrid technology, determine CTZFP8 interaction proteins；using Chromatin immunoprecipation Sequencing, screen the target genes of CTZFP8.These differential research may have a cognition on the cellular functioning of CTZFP8 under cold stress condition.

我们通过水稻孕穗期耐冷性QTL分析与生物信息学分析相结合的方法分离了C2H2型锌指结构转录因子，CTZFP8，并构建CTZFP8基因的超量表达转基因材料已验证了其耐冷功能。本项目以CTZFP8基因为研究对象，通过Q-PCR技术研究水稻不同组织、不同时期期响应低温、高盐、干旱、ABA等环境因子的mRNA表达谱变化；构建CTZFP8基因的RNA干扰载体和删除EAR转录抑制结构域的超量表达载体，通过农杆菌介导法转入水稻早熟品种Kitaake，结合超量表达转基因材料分析CTZFP8基因在水稻低温冷害中的作用及对生长发育的影响；通过GFP瞬时表达和GUS染色法确认亚细胞定位及组织特异性表达；利用酵母双杂交技术分析CTZFP8的互作蛋白；利用CHIP-Seq方法鉴定CTZFP8的靶基因。通过这些研究，解析CTZFP8基因在水稻中的耐冷机制，为水稻耐冷机理研究提供理论基础。

水稻是世界上最重要的粮食作物，为全球一半的人口提供粮食。水稻对温度敏感，低温严重影响其生长和产量。本项目开展了水稻锌脂蛋白基因OsCTZFP8的分离其生物学功能研究，该基因是水稻中新发现的与低温相关的C2H2型锌脂蛋白基因。基因表达研究表明，OsCTZFP8基因被多种非生物胁迫诱导，特别是在低温诱导处理5h后诱导活性达到最高值。亚细胞定位分析表明，OsCTZFP8-smGFP定位到细胞核中。QRT-PCR组织特异性表达结果表明，OsCTZFP8在水稻叶片中的表达量最高，根、茎、花粉、胚乳中的表达量不高并且差异不大。通过对OsCTZFP8基因过量表达水稻、RNAi转基因水稻与非转基因对照品种的耐冷性鉴定，发现OsCTZFP8基因的过量表达能够明显提高转基因水稻的耐冷性，即过量表达株系的花粉育性和种子结实率高于非转基因对照品种，对照品种与RNAi转基因株系之间没有显著差异。通过转录组测序，初步筛选出OsCTZFP8的靶基因。通过酵母双杂筛选出OsCTZFP8的互作蛋白。以上结果表明，OsCTZFP8基因是在水稻生殖生长期具有耐冷性的新型锌指蛋白基因，可推测该基因可能参与水稻低温胁迫调控过程。此项研究结果为水稻耐冷育种提供了种质资源，并为耐冷机理研究提供了理论基础。