靶向输送siRNA沉默Livin基因治疗恶性黑素瘤的实验研究

基因治疗为恶性黑素瘤(MM)的治疗带来了希望，但核酸药物在体内的靶向输送是制约其向临床应用发展的瓶颈。我们前期的体外研究发现，Livin是采用siRNA方法进行MM基因治疗探索的理想靶基因，值得在体内进一步研究，向临床应用发展；然而，如何在体内将针对Livin的siRNA准确、高效地输送到MM组织细胞依然是亟待解决的关键问题。本研究拟利用抗MM的单链抗体与抗原特异结合的导向作用，将其与具有核酸结合活性的鱼精蛋白融合，建立同时具有抗原和核酸结合活性的抗MM单链抗体/鱼精蛋白融合蛋白的siRNA靶向输送系统，以实现沉默Livin的siRNA在体内向MM组织细胞的靶向输送；并探讨siRNA在荷瘤裸鼠体内靶向沉默Livin对MM细胞凋亡及肿瘤生长的影响。本研究将为siRNA在体内向MM组织细胞的靶向输送提供可行的方法，并为siRNA靶向沉默Livin治疗MM的基因治疗探索向临床应用迈进奠定基础。

本研究按原定计划按时结题。通过PCR方法将鱼精蛋白截短片段序列与抗黑色素瘤细胞表面抗原单链抗体基因相连接，构建GST融合蛋白表达载体以实现在大肠杆菌中该融合蛋白的可溶性表达，经酶切等一系列纯化后，该融合蛋白通过凝胶阻滞电泳迁移率变动分析证明具有明显的携载siRNA的能力；分别采用FITC及TRITC标记并与细胞共孵育后，通过流式细胞术及激光共聚焦显微检测，表明该融合蛋白具有与黑色素瘤LiBr细胞特异性的结合能力；采用不同浓度siRNA与蛋白混合与细胞孵育后观察，结果表明该融合蛋白具有将siRNA内化至细胞的能力。通过小动物活体成像仪检测，该蛋白可在黑素瘤荷瘤裸鼠的肿瘤部位富集，表明具有良好的靶向性。在体外，经序列筛选，确定该靶向系统携载针对Livin基因下游下游790-808位点的siRNA，即anti-MM scFv-tP-siRNA，靶向该位点的siRNA可引发Livin基因沉默，导致Livin mRNA和蛋白表达下调。anti-MM scFv-tP-siRNA以不同浓度与LiBr细胞孵育并在不同时间分别在mRNA水平采用Real-time RT-PCR和蛋白水平采用Western blot检测其对Livin基因的沉默效应，结果显示，anti-MM scFv-tP-siRNA对Livin mRNA和蛋白的沉默效应在一定范围内呈剂量、时间依赖方式，达到沉默Livin基因最大效应的最适浓度是200nM，下调Livin mRNA表达的最大效应在转染后48h；anti-MM scFv-tP-siRNA以200nM浓度与LiBr细胞孵育后采用Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡和MTT检测细胞增殖，结果显示，siRNA沉默Livin后LiBr细胞的凋亡指数和早、晚期凋亡率均明显升高，细胞增殖抑制。anti-MM scFv-tP-siRNA通过尾静脉注射黑素瘤荷瘤裸鼠后，可明显抑制肿瘤生长，瘤细胞团明显减少，抑制肿瘤细胞增殖。Real-time RT-PCR和Western blot检测证实，黑色素瘤组织的Livin表达下调，Procaspase-3表达升高和出现caspase-3活化片断。本研究为siRNA 在体内向MM 组织细胞的靶向输送提供可行的方法，并为其他肿瘤的基因治疗探索提供了思路。