Exosome负载的分子信息在淋巴瘤侵袭与进展恶性生物学行为中的机制研究

In this study, we intend to fully investigate the biological characteristics of lymphoma exosomes in vitro and in vivo using lymphoma cell lines, bone marrow stromal cells, mononuclear cells isolated from peripheral blood/tonsil, mouse strains and lymphoma patients as models, and obtain evidence of direct causal relationship between the transfer of exosomal cargo and the invasion/progression of lymphoma. Further steps are designed to clarify the involvement of exosome in the remote transmission of lymphoma's malignant features and the intercellular communications with the tumor microenvironment resulting in the phenotype exchange, understanding the bio-effect pattern as well as the corresponding molecular mechanisms; to elucidate the interference of exosome with potential heterogeneity factors e.g. lymphoma stem cells causing drug resistance to conventional chemotherapy or even Rituximab, and the rescue strategies; to identify circulating exosomal biomarkers related to the development, proliferation, drug resistance, progression and relapse of lymphoma that can be used for early diagnosis, response evaluation, prognosis prediction and follow-up monitoring. A complete comprehensive knowledge of characteristics of lymphoma exosome would help better understand the pathogenesis of lymphoma and resolve practical problems regarding to diagnosis, treatment, and follow-up, thus provide great values in clinical application.

本课题以淋巴瘤细胞系、骨髓基质细胞、外周血/扁桃腺单个核细胞、小鼠模型、淋巴瘤患者为研究对象，经体外体内试验系统研究淋巴瘤Exosome的生物学特性并获取Exosome传递负载分子信息致淋巴瘤侵袭与进展的直接证据，阐明Exosome参与淋巴瘤恶性特征的远处传播与肿瘤微环境之间的交流及表型转化的生物效应模式以及相关分子机制；Exosome影响淋巴瘤干细胞等异质性因素在耐药机制包括化疗药耐受与利妥昔单抗耐受中的作用及相应干预策略；发掘与淋巴瘤发生发展、增殖耐药、进展复发等恶性生物学行为相关的循环血清Exosome标志物，用于早期诊断、疗效评估、预后判断及随访监测。对淋巴瘤Exosome生物学效应的全面了解将有助于理解淋巴瘤发病机制并解决诊断、治疗、随访中涉及的实际问题，具有较大的临床应用价值。

弥漫大B细胞淋巴瘤是成人非霍奇金淋巴瘤中最常见的一种类型，具有高度异质性。外泌体是一种能被大多数细胞分泌释放的细胞外膜性囊泡结构，存在于许多体液中，如血液、尿液、唾液等。外泌体内负载有脂质、大量蛋白质、核酸。作为运输和存储工具，外泌体在邻近或远处细胞间及细胞与胞外环境间运载传递这些生物活性分子，介导免疫应答、细胞凋亡、血管发生、炎症反应、细胞增殖等众多生理病理过程。以淋巴瘤外泌体为研究对象，与淋巴瘤细胞株进行共培养，以台盼蓝拒染法检测细胞增殖、CCK-8法检测细胞株对化疗药的敏感性、Transwell小室法检测细胞迁移和侵袭，结果显示淋巴瘤外泌体能显著增加淋巴瘤细胞的增殖、迁移和侵袭能力，耐药株淋巴瘤细胞源性外泌体能显著抑制敏感株淋巴瘤细胞对DOX的敏感性。将不同分期DLBCL患者和健康人血清外泌体进行蛋白质组学分析，结果显示高危预后差组（A组）的外泌体相较于低位预后好组（B组）和健康对照组（C组），高表达的差异蛋白有37种，进行KEGG富集分析，得到7条有意义的富集通路，其中TNC和VWF共同参与的3条通路，分别为ECM-receptor interaction、PI3K-Akt signaling pathway和Focal adhesion。使用String网站对37种上调蛋白进行蛋白质-蛋白质相互作用网络分析，得出重要的节点蛋白有：HSPA8、VWF、LRG1。分别进行WB验证，结果显示A组VWF表达量明显高于B组（P＜0.001）和C组（P＜0.001），而B组和C组之间没有统计学差异；并且VWF表达量与患者的总体生存（OS）和无进展生存（PFS）明显相关，VWF表达量高者OS（P＜0.001）和PFS（P＜0.001）均明显低于VWF表达量低者，差异有统计学意义。提示患者血清外泌体VWF可能是淋巴瘤患者的不利预后因素，在肿瘤进展中发挥重要作用，可能是淋巴瘤外泌体经由细胞间交流促进肿瘤侵袭与进展的关键蛋白。为了探索淋巴瘤外泌体中的LRG1是否可以通过MAPK信号通路促进肿瘤细胞的增殖和转移，将病人血清外泌体分别与Su细胞和Raji细胞共孵育，WB检测P-P38、P-JNK和P-ERK的变化，结果显示外泌体对P-P38和P-JNK没有影响，反而能使P-ERK的表达量下降。