MicroRNA-21通过对T细胞的基因调控抑制角膜移植排斥的研究

The main reason for the failure of corneal transplantation is corneal allograft rejection, there are 2 million corneal blindness who need corneal transplantation in our country. As we all known ,the key to prevent transplant rejection is to inhibit T-lymophocyte-mediated delayed-type hypersensitivity. But the existing treatment of regulating T-lymophocyte can not control rejection effectively. In recent years, immune academia gives high concerning on gene acommodation of T-cell immune regulation with miRNAs. Our study had some preliminary works .On the basis of observing that miRNA-21 regulate T-cell seriously, we will set up the model of mouse corneal transplantation, using the technology of molecular biology, immunology, flow cytometry , 1) study the mechanism about how the miRNA-21 regulate activated Treg,Th1,Th2 ,Th17 cells on the time of corneal allograft rejection ; 2) study how the NF-kB-miRNA21 signal transduction pathways influence various types of T cells in corneal allograft rejection; 3) observe how the miRNA-21 influence rejection rate when it is target regulating . By this study , we can probe into the mechanism on how the miRNA-21 influence corneal allograft rejection by regulating CD4+ T cell. We can explore the new ways of prevention and treatment of immune rejection after corneal transplantation through this study.

我国约有200万需角膜移植的角膜盲患者，移植排斥是导致手术失败的主要原因。已知抑制T淋巴细胞介导的迟发型超敏反应是防治移植排斥的关键，但是现有调控T细胞的治疗方法并不能有效控制排斥。近年，miRNAs通过对T细胞的基因调控来调节免疫系统引起了免疫学界的高度关注，本项目在前期工作观察到miRNA-21对CD4+T细胞活化有明显的调控作用的基础上，拟建立小鼠角膜移植模型，采用分子生物学、免疫学、流式细胞等技术，1）研究miRNA-21在基因表达调控水平调控角膜移植排斥时眼内Th1、Th2、Th17、Treg细胞活化的作用机制；2）研究NF-κB-miRNA-21信号转导通路在角膜移植排斥时对T细胞的影响；3）观察以miRNA-21进行靶向治疗，对排斥发生率的影响。通过本研究探讨miRNA-21对T细胞的基因调控来影响角膜移植排斥反应的作用机制，以期探寻防治角膜移植术后免疫排斥的新途径。

项目背景：我国角膜盲患者约400万，角膜移植手术是复明的主要手段，而移植术后免疫排斥反应是导致植片失败的重要原因，目前缺少有效防治方法。因此寻找新的手段来抑制角膜移植术后的免疫排斥反应是角膜病临床研究中亟待解决的科学问题。近年，微小RNA(microRNA，miRNA)参与免疫调节引起了免疫学界的高度关注，具有应用于防治移植排斥的巨大潜能。但目前尚无与角膜移植排斥反应相关的miRNA的报道。因此，研究角膜移植免疫排斥反应中发挥主要作用的miRNA及其作用机制具有重要的意义。研究内容：体外实验分离小鼠脾脏采用流式细胞仪观察miRN-21对T细胞的作用；建立小鼠穿透性角膜移植术模型；进行基因芯片和生物信息学分析，比较在异系移植排斥组与原位移植组中差异表达的miRNA；Realtime PCR验证差异表达的miRNA；双荧光素酶报告基因系统、Realtime PCR和Western Blot确定miR-122的靶基因；慢病毒系统表达miR-122结合位点野生型或突变型的CPEB1，促炎细胞因子TNFα/IL-1β/TNFγ刺激角膜基质细胞并检测其凋亡；在异系移植组增加miR-122的表达并观察其对排斥率的影响；对大样本角膜移植术后的临床观察。重要结果：体外实验发现miRNA-21通过NF-κB信号转导通路对Th1、Th2、Th17细胞具有显著的调控作用；通过芯片和Realtime PCR分析，在异系移植排斥组中miR-122的表达显著下调，miR-21相关性弱；生物信息学结果表明CPEB1为miR-122的靶基因，且其在异系移植排斥组中表达显著上调，而在小鼠角膜上皮祖细胞系中高表达miR-122可显著降低CPEB1的表达；双荧光素酶报告结果表明，miR-122可通过与CPEB1基因的3'-UTR 结合下调CPEB1的表达；当在角膜基质细胞系中抑制miR-122的表达或增加CPEB1的表达，角膜基质细胞系的凋亡显著增加，并且MiR-122通过下调CPEB1来阻止角膜基质细胞的凋亡；增加miR-122的表达能降低角膜移植排斥的风险；临床观察总结移植排斥的临床特征与分类，对于指导诊断和鉴别诊断具有重要意义。科学意义： miR-122是与角膜移植排斥相关的重要microRNA，通过降低其靶基因CPEB1的表达，miR-122能阻止角膜基质细胞的凋亡从而显著降低角膜移植排斥的风险。