肿瘤表面糖蛋白的快速分离与鉴定

肿瘤细胞表面糖蛋白的结构和功能在肿瘤免疫中有着重要作用，因此开展肿瘤相关糖蛋白的研究一直是肿瘤分子生物学关注的焦点。本研究从肿瘤细胞表面糖蛋白的研究方法入手，建立一套N-糖基化糖蛋白的特异性分离和鉴定方法，为开展肿瘤糖蛋白质组学的研究提供有效的技术支撑。本研究首先利用代谢标记技术，采用自行合成的含有叠氮基团的乙酰化葡萄糖和甘露糖分别培养肿瘤细胞，使细胞表面的糖蛋白被含叠氮基团的糖转糖基化；随后同自行合成的炔基化亚氨基生物素进行点击化学反应，使膜上的糖蛋白生物素化；生物素化的糖蛋白借助于链霉亲和素固定化的磁性微球进行分离；分离的糖蛋白进而通过二维电泳、质谱解析完成对其的筛选及鉴定工作。本研究应用化学生物学、蛋白质组学、糖生物学等基本理论，结合代谢标记、点击化学和磁性分离技术，探讨肿瘤细胞表面糖蛋白的分离鉴定方法，为肿瘤相关糖蛋白质组学的研究提供技术支持，具有重要的理论和应用价值。

本研究合成了系列小分子非天然单糖探针12种及检测探针11种，通过自行合成的互补探针，构建了对非天然单糖代谢效率的检测体系，同时构建了基于点击化学的细胞表面糖蛋白特别是唾液酸化糖蛋白的代谢标记体系，为肿瘤表面糖蛋白的研究提供了独特的方法。采用构建的糖蛋白分离与鉴定体系，结合HPLC-MS/MS与生物信息学工具，对肿瘤细胞表面糖蛋白进行分析鉴定，获得56种糖蛋白，随机挑选9种进行mRNA水平和蛋白水平的检测，与质谱结果基本相符（90%），即本研究成功建立了糖蛋白的分离和鉴定方法，并可用于潜在的肿瘤Marker筛选。此外，采用分离糖蛋白进行拓展研究，建立了一种模拟肿瘤细胞表面糖蛋白的纳米荧光探针示踪方法，并以此模拟肿瘤细胞，着重研究肿瘤细胞膜糖蛋白对免疫系统的激活作用，为肿瘤免疫与逃逸机制的研究，以及糖蛋白疫苗的合成与开发提供工具与方法。