HBV cccDNA小鼠模型的建立与cccDNA保持体内稳定性的机制研究

HBV covalently-closed-circular DNA (cccDNA) can long persist in vivo and is almost incurable by current treatments. However, no convenient and relevant animal models currently exist that can be used to study the mechanism of HBV cccDNA persistence in vivo. Recently, we have observed that inhibition of viral protein expression and/or genome replication does not reduce cccDNA stability, but that some specific DNA sequence plays a key role in cccDNA maintenance in cell culture models. In this project, we will generate a mouse model to produce HBV cccDNA specifically in mouse hepatocytes, and we will study the mechanism of HBV cccDNA maintenance in vivo. Firstly, we will generate a transgenic mouse expressing PhiC31 recombinase specifically in hepatocytes, which will convert the linear HBV genomic DNA delivered by an AAV vector into circular cccDNA, and will study the stability and pathogenesis of this cccDNA in different immune backgrouds. Then, we will compare the structure of the cccDNA minichromosome in both mouse models and HBV patients using ChIP-Seq. Finally, we will characterize the contribution of DNA sequence to cccDNA maintenance through a series of HBV mutants. This mouse model will benefit the functional study of cccDNA and its interaction with host factors in vivo, will help bridge the gap between basic research and clinical application, and will provide a highly efficient platform for developing new therapeutics to cure HBV.

HBV cccDNA在体内长期稳定且无法清除。尚无动物模型可供研究HBV cccDNA维持体内稳定的机制。我们发现，抑制病毒蛋白表达和基因组复制均不能降低其稳定性，但HBV特定DNA序列对维持其稳定至关重要。本课题将构建一个可在肝脏特异性产生cccDNA的小鼠模型，研究其稳定机制。首先，构建肝脏组织特异表达PhiC31重组酶的转基因小鼠，HBV线性基因组借助AAV载体高效递送到肝脏细胞并通过重组生成环状cccDNA；然后，研究不同免疫状态下cccDNA的体内稳定性与致病性；并对比cccDNA在鼠肝内与乙肝病人体内的结构特征；最后，通过构建系列突变体, 验证DNA序列对维持cccDNA体内稳定性的作用，从而阐释其体内稳定性的维持机制。该模型可用于从动物整体水平上研究cccDNA的功能及其与宿主相互作用，将搭建基础与临床之间的桥梁，为开发治愈HBV的新型治疗策略提供高效的动物平台。

乙肝是威胁我国生命健康的最大的慢性病毒性传染病。其cccDNA 稳定存在是难于根治的主要原因，目前，缺少合适的体内和体外模型。本研究致力于构建一个研究HBV cccDNA稳定的小鼠模型，并对cccDNA 的稳定性进行机制上的剖析，为开发新靶点和新治疗方案服务。.1. 构建了可以在C57-PhiC31-ERT2小鼠体内通过Tamoxifen诱导形成HBV cccDNA且表达荧光素酶报告基因的cccDNA报告模型，为体内研究HBV cccDNA的功能性治愈提供了新技术平台。.2. 在模型中证明了纯粹的HBV cccDNA可以稳定24周以上，且能够引起肝脏免疫细胞浸润，并可诱导肝脏纤维化，为阐述HBV cccDNA的存在导致的疾病发生提供了新手段。.3. 详细通过遗传学手段分析了HBV cccDNA稳定的分子机制，发现不是HBV的病毒蛋白，而是HBV cccDNA的某个片段决定了整个cccDNA的稳定性，为开发治愈性药物确定了新靶点。.4. 通过儿童HBV患者的干扰素临床试验进一步证实了干扰素在实现HBV功能性至于方面的无穷潜力，遂在现有模型基础上开发了干扰素受体人源化的小鼠模型。一方面证明了该小鼠模型对人干扰素应答与人体应答的一致性（图15），另一方面也在这个模型上突破性的证明人干扰素可以在在小鼠AAV-HBV小鼠模型上降低HBsAg水平(图16)。该模型是从机制上解析干扰素治愈HBV 不可多得的技术平台，也为干扰素联合治愈HBV策略提供了方便之门。.5. 项目实施过程中，利用对HBV cccDNA与相关小鼠模型的了解，开发了4项专利，其中1项专利（名称：一种从乙型肝炎病毒总核酸中选择性扩增RNA的PCR引物、试剂盒和方法，申请号：201710661443.9）是HBV 功能性治愈效果评价的，该专利已经转让给中山大学达安基因股份有限公司。将课题所得研究成果直接转化成了服务于社会生产力。