泛素连接酶CHIP通过miR-92b/PTEN调控胶质瘤恶性增殖的机制研究

Glioma is the most common malignant tumor in CNS.The primary reason of glioma causing death is tumor proliferation.So it is very important to explore the new mechanism.Our previous experiments have shown that CHIP was abnormal expressed in gliomas.At the same time,microRNA-92b expression increased abnormally in gliomas by microRNA array analysis,and Luciferase Reporter Assay have shown that PTEN was a target of microRNA-92b.In addition ,the tumor signal protein chip analysis have shown that the pathway of PI3K-Akt/FOXO were abnormally activated. PTEN can inactivate PI3K .And the pathways of PI3K-Akt/FOXO are downstream signaling pathways.In this experiment ,we will verify the CHIP regulate the target PTEN and the downstream pathways of PI3K-Akt/FOXO through microRNA-92b at the levels of molecule,cell,animal and histopathology.Our research project aims to establish that CHIP can be used as a therapertic target for invasive maligant glioma,and to provide a theoretical basis for developing a novel therapy in the human glioma and improve the clinical treatment effect.

脑胶质瘤是颅内最常见的恶性肿瘤，其侵袭性增殖复发是致死的主要原因。因此，探寻胶质瘤恶性增殖的机制具有十分重要的意义。课题组前期研究发现，泛素连接酶CHIP在肿瘤中表达异常增高，体内外研究发现CHIP与细胞增殖能力相关；结合microRNA芯片分析发现，CHIP可调控microRNA-92b表达。同时，我们利用肿瘤信号蛋白芯片筛选发现CHIP过表达后，PI3K-Akt/FOXO 通路异常活化。为了分析其作用机制，我们通过双荧光素报告实验及western blot验证PTEN是miR-92b的靶基因，能够特异性结合PI3K，是PI3K-Akt通路的关键调控分子，因此本研究拟通过分子，细胞，动物实验以及临床组织标本水平验证CHIP通过miR-92b作用其靶基因PTEN调控下游PI3K-Akt/FOXO1通路在胶质瘤恶性增殖行为中的机制研究，以期为恶性胶质瘤临床治疗提供新靶点。

本研究从细胞水平和动物水平，通过定量RT-PCR、免疫组织化学、免疫荧光、免疫印迹、慢病毒RNA干扰等方法，研究E3泛素连接酶CHIP调节脑胶质瘤恶性生物学特性的病理机制。构建AffymatrixmiRNA芯片并分析其数据，生物信息学进行拟合和聚类。寻找差异表达的miRNA及其靶基因，在T98G和LN229胶质瘤细胞株中，利用实时定量RT-PCR、免疫印迹、荧光素报告实验等方法，研究CHIP下游调控的分子。当CHIP表达下调时，miR-92b下调达26倍，胶质瘤细胞的增殖、克隆形成能力随之减弱，此时再过表达miR-92b能够回复胶质瘤细胞的恶性生物学行为。CHIP通过诱导miR-92b过表达，负向调控PTEN分子。miR-92b表达降低后带来的细胞增殖能力、克隆形成能力减弱，可通过敲减PTEN回复。提示miR-92b和PTEN是CHIP的下游分子，三者共同形成一调控轴，促进胶质瘤的恶性增殖、克隆形成及凋亡抵抗。使用Western blot方法检测PI3K/Akt下游信号分子的蛋白表达水平，利用RNAi方法敲减Akt后，采用MTT法检测细胞增殖，采用流式细胞仪检测细胞凋亡，构建裸鼠皮下成瘤模型观察瘤体大小，并取下肿瘤采用免疫组化方式进行染色，观察相关指标表达水平。当通过转入miR-92b或RNAi的方法抑制PTEN表达水平之后，p-Akt,p-mTOR，p-p70S6K,p-4E-BP1和survivin表达水平均上调，伴有细胞增殖增快、凋亡减少等恶性表型，但在Akt表达下调之后，该表型可回复正常。对裸鼠皮下构建的胶质瘤成瘤模型，靶向CHIP的慢病毒能够显著抑制肿瘤的生长，瘤体内miR-92b低表达、PTEN高表达、Ki-67也呈低表达状态。CHIP对胶质母细胞瘤恶性生物学行为的调控是通过PI3K/Akt通路进行的，Akt是CHIP/miR-92b/PTEN调控轴的效应分子。我们本研究的实验结果提示:CHIP通过miR-92b/PTEN调控轴，实现了对RTK通路PI3K-Akt的激活，有可能作为GBM间质转化的重要上游调控分子，甚至有可能作为未来间质亚型GBM的分子标记物，survivin可能是其重要的下游效应分子。这对于未来在组织水平对胶质母细胞瘤进行进一步的分子分型，进而催生针对胶质母细胞瘤亚型的精准靶向治疗的方案，提供了重要的依据。